学霸归纳-蛋白质与蛋白质组

1、蛋白质与蛋白质组伍乘风出品Chapter 1.Protein structure1. Regulation of protein function: Expression, Transportation and localization, Modification, Interaction, Degradation.2. Proteins generally have 50 amino acid residues.3. Levels of structure:1) Amino acid residue sequence2) Structural elements3) Specific 3-di

2、mensional structure4) Arrangement of subunits in multi-subunit protein4. There are over 300 naturally occurring amino acids on earth, but the number of different amino acids in proteins is only 20.5. Classification of amino acids:1) Acidic: aspartate(Asp, D), glutamate(Glu, E).2) Basic: lysine(Lys,

3、K), arginine(Arg, R), histidine(His, H).3) Aromatic: tyrosine(Tyr, Y), tryptophan(Trp, W), phenyl-alanine(Phe, F).4) Sulfur: cysteine(Cys, C), methionine(Met, M).5) Uncharged hydrophilic: serine(Ser, S), threonine(Thr, T), asparagine(Asn, N), glutamine(Glu, Q).6) Inactive hydrophobic: glycine(Gly, G

4、), valine(Val, V), leucine(Leu, L), isoleucine(Ile, I).7) Special structure: proline(Pro,P) is often located at the turn of a peptide chain.6. Interaction between positive and negative R groups may form a salt bridge, which is an important stabilizing force in proteins.7. The synthesis of all peptid

5、e chains starts from methionine.8. Two additional amino acids: selenocystein(硒半胱氨酸,UGA) and pyrrolysine(吡咯赖氨酸,UAG). The unusual amino acid is specified by a canonical(标准的) stop codon.9. The appropriate tRNA is initially charged with serine, which is subsequently modified to selenocysteine. However,

6、tRNA can be directly charged with pyrrolysine, which represents the first case of tRNA charging with a non-canonical amino acid.10. Trp, Tyr, and to a lesser exten Phe, absorb ultraviolet light, which accounts for the characteristic strong absorbance of light by proteins at a wave length of 280 nm.1

7、1. Nonstandard amino acid: Derived from one of the 20 standard amino acids, in a modification reaction that occurs after the standard amino acid has inserted into a protein.12. Three ways to obtain a peptide:1) Purification from tissue2) Genetic engineering3) Direct chemical synthesis13. Solid phase

8、 peptide synthesis(SPPS):1) Pre-treatment of amino acids2) Formation of peptide bond3) Deprotect, hydrolyze and purification14. Biological and chemical synthesis of peptides:l Common points1) Activation of carboxyl group2) Step by stepl Differences 1) Template2) Orientation: for biological synthesis

9、, it is from “N” to “C”. For chemical ways, it is from “C” to “N”.3) Efficiency4) Condition5) size15. Elucidation of antigenic peptide sequences in proteins by epitope mapping(表位作图).16. Edman degradation1) Coupling: the N of the protein couples with PITC under basic conditions to form a PTC(phenylth

10、iocarbamyl苯氨基硫甲酰)-polypeptide.2) Cleavage: the peptide bond of the N PTC-residue undergoes acid cleavage from the polypeptide chain, releasing an unstable ATZ derivative of the amino acid.3) Conversion: the unstable ATZ-amino acid is converted into the corresponding stable PTH derivative.17. Large p

11、roteins sequencing:1) Breaking disulfide bonds2) Cleaving the polypeptide chain3) Sequencing of peptides4) Ordering peptide fragments5) Locating disulfide bonds18. A protein that is related to another by common evolutionary history(homologous proteins).19. The features of an helix:1) Every 3.6 resid

12、ues make one turn2) The distance between two turns is 0.54 nm3) The C=O of one turn is hydrogen bonded to N-H of the neighboring turn 4) An helix can be either right-handed or left-handed.20. -turns:1) a common structural element used to redirect the chain.2) A -turn is made of 4 residues. The carbo

13、nyl O fo the first residue is hydrogen bonded to the N of the fourth residue.21. Fibrous proteins:1) -keratin: coiled-coil of helices2) -keratin: stacked sheets. Alternating Ala-Gly allows close packing of Alas methyl group in silk.3) Collagen: usual sequence is repeats of Gly-X-(Hy)Pro. Three left-

14、handed helices wrap around each other in a right-handed spiral. The Glys are at core of bundles.22. Domains: the stable unit of protein folding and tertiary structure. Different domains in a protein may have different function.23. Advantages of multi-domains1) Efficient folding2) Larger folded prote

15、ins.3) Flexibility and motion4) Union of new function24. The force governing subunit association:1) Ionic interactions2) Hydrophobic interactions3) The secondary structure25. Reasons for using multimerc(多聚体的) assemblies of protomers(原体)：1) Allows larger protein without increasing genetic information

16、 required to code for it.2) Error rate is not such a factor3) Interaction sites can be at interface26. Try to predict structures based on the primary sequences, using:1) Known structures2) Tendencies of amino acids3) Energy minimization27. Measure/monitor protein folding1) CD(circular dichroism圆二色性)

17、 can measure conten of regular structures like helix and sheet.2) Trp fluorescence increases in hydrophobic environment.28. Forces acting on proteins1) Hydrogen bonding2) Van der Waals interactions3) Ion pairing4) Disulfide bonds5) Intrinsic properties6) Hydrophobicity: the dominant force in protein

18、 folding29. The relationship between primary structure and conformation:1) Change primary structurechange conformation2) Change primary structurewithout change of conformation3) Change conformationwithout change of primary structureChapter 2.Protein folding, misfolding and disease1. Protein folding

19、is the process by which a protein assumes its functional shape or conformation.2. Stringent(严格的) quality-control systems ensure that the misfolded products are targeted for degradation before the cause harm.3. Native states of proteins almost always correspond to the structures that are mos thermody

20、namically stable under physiological conditions.4. The folding process is a stochastic(随机的) search of the many conformations accessible to a polypeptide. Finally find its lowest-energy structure by a process of trial and error.5. Larger proteins generally fold in modules(模块). 6. Co-translational: fo

21、lding is initiated before the completion of protein synthesis.7. Post-translation: folding is initiated after release from the ribosome.8. Molecular chaperones are involved in folding to ensure that the various stages in the folding of such systems are all completed efficiently. They increase the ef

22、ficiency by reducing the probability of competing reactions, particularly aggregation.9. Peptidylprolyl isomerases increase the rate of cistrans isomerization of peptide bonds involving proline residues.10. Protein disulphide isomerases enhance the rate of formation and reorganization of disulphide

23、bonds.11. Function of chaperones(need ATP): 1. prevent misfolding; 2. Rescue misfolded and even aggregated proteins.12. The structural maturation of many proteins synthesized in the ER is slow and inefficient, probably because they require several post-translational modifications (for example, signa

24、l sequence cleavage, N-linked glycosylation, disulphide-bond formation and reshuffling, addition of glycosylphosphatidyl-inositol anchors, insertion of membrane proteins in the lipid bilayer).13. Quality-control in ER1) ER resident chaperones or oxidoreductases interact with intermediates who expose

25、 hydrophobic surfaces, unpaired cysteines or immature glycans, and as a consequence they are retained in the ER or retrieved from the Golgi complex.2) primary quality control monitors proteins architectural design through ubiquitous folding sensors.3) Secondary quality-control mechanisms rely instea

26、d on cell-specific factors and facilitate export of proteins.4) glycosylation and deglycosylation reactions enables correctly folded proteins to be distinguished from misfolded ones.14. Heat shock response and unfolded protein response induce the expression of genes encoding the protein chaperones a

27、nd folding catalysts. In this way, the cell up-regulates its protein-folding capacity.15. Protein turnover: Proteins within cells are continually being degraded to amino acids and replaced by newly synthesized proteins. This process is highly selective and precisely regulated.16. ubiquitinproteasome

28、 pathway: In eukaryotic cells, most proteins destined for degradation are labeled first by ubiquitin and then digested by the 26S proteasome.17. Many proteins of major medical importance (such as insulin) cannot fold properly in E. coli, are recognized as abnormal and are rapidly degraded. Successfu

29、l expression of such proteins required the development of mutant bacteria with reduced degradative capacity or improved expression systems that overwhelm the proteolytic systems.18. Bacteria have a specialized mechanism to target for destruction incomplete polypeptides while they are still on stalle

30、d ribosomes.19. The quality-control systems do not degrade all, or even most, mutated proteins: only those mutations that markedly perturb protein folding trigger rapid hydrolysis20. The degradation of free subunits of multimeric enzymes thus not only protects cells against accumulation of denatured

31、, potentially toxic polypeptides but also ensures that subunits of multimeric complexes are present in the proper proportion.21. ATP-dependent cytosolic systems exist in both bacteria and eukaryotic cells.It involves special protease in E. coli and ubiquitin-proteasome pathway in eukaryotic cells.22

32、. ER-associated degradation(ERAD): To maintain homeostasis, terminally misfolded molecules are retrotranslocated or dislocated(脱位的、移位的) across the ER membrane to be degraded by cytosolic proteasomes. 23. Common characteristics of amyloid deposits1) Specific optical behaviouron binding certain dye(染料

33、) molecules.2) The fibrillar structures with similar typical morphologies（形态） (long, unbranched and often twisted structures, a few nanometres in diameter).3) There are striking similarities in the aggregation behaviour of different peptides and proteins.Chapter 3. Regulation of protein functions1.

34、Expression: level; temporal; spatial2. Localization and translocation: most lysosomal, membrane, or secreted proteins have an amino terminal signal sequence.3. Common features of signal peptides:1) About 1015 hydrophobic amino acid residues2) 疏水残基之前的N端含有1个或几个带正电的基团。3) 靠近切割位点的C端含有小段极性短侧链氨基酸。4. 运输到线粒体

35、和叶绿体的蛋白的信号序列（signal sequence）被胞质中的分子伴侣包裹，与靶细胞器外膜受体结合后通过蛋白通道进入细胞器。其后，信号序列被切除。5. 核定位序列NLS可以位于肽链的任何位置，而且最终不会被切除。6. Modification: phosphorylation; glycosylation; methylation; acetylation; ubiquitination.7. 细胞通过对已存在的蛋白的翻译后修饰来对外界环境作出反应。8. Consequences of protein modifications: 1) Conformation change2) Tra

36、nslocation3) Protein interaction9. Interaction and dissociation10. DegradationChapter 4. Protein phosphorylation1. Phosphorylation refers to the addition of a phosphate to one of the amino acid side chains of a protein.2. Regulation by phosphorylation:1) Change the biological activity of an enzyme(由

37、于磷酸带负电，与磷酸连接可以导致蛋白质构象发生变化)2) Helping move proteins between subcellular compartments3) Allowing interactions between proteins to occur4) Labeling proteins for degradation3. phosphorylation of the protein will act as a molecular switch, turning the activity on or off.4. The hydroxyl groups of Ser, Thr

38、, Tyr or His side chains are the most common target for protein kinases.5. 一些激酶与磷酸酶的特异性很强，另一些则能广泛作用于很多蛋白。6. 利用磷酸化/去磷酸化来调节蛋白活性的优势：1) 迅速2) 不需要合成新蛋白或降解已有蛋白3) 简单可逆7. 外部信号可以激活蛋白激酶或磷酸酶，通过磷酸化级联反应引起一些列生理变化。动物细胞中，这一级联反应由丝氨酸/苏氨酸激酶和酪氨酸激酶调节。8. 磷酸化可能不改变蛋白的活性，而是提供磷酸化的位点与其他蛋白作用。例如在信号转导过程中，一些膜蛋白磷酸化后与胞质中的蛋白结合，从而起到了局

39、部富集的作用，是一些原本难以靠近的蛋白靠在一起，从而激活其他蛋白。9. 激酶的分类可以根据靶氨基酸的不同；底物的特异性和调节剂（regulators）的不同。10. 蛋白激酶的调节：1) 激活蛋白2) 抑制蛋白：假底物；自抑制（激酶的部分结构域类似假底物）。3) 配体与调节亚基的结合4) 辅因子和第二信使5) 反式磷酸化（其他蛋白激酶）或顺式/自磷酸化（自身）。6) 细胞内的定位11. PKA：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；依赖cAMP；通过激活磷酸二酯酶进行反馈性抑制。可调节糖和脂代谢。12. PKD：丝氨酸/苏氨酸激酶，在生长因子信号转导途径和压力诱导信号途径中扮演重要的角色。13. 受体酪氨酸

40、激酶：由跨膜受体和细胞内侧的激酶活性域组成。平时以单体形式存在，与配体结合后形成同源或异源二聚体，两单体间相互磷酸化（反式-自磷酸化）发挥作用。14. Adaptor（衔接子） proteins are specialized protein binding partners that serve to link signaling proteins to each other, as a mechanism to propagate a cellular signal. Chapter 5. Glycosylation1. 糖基化的作用：1) 确保蛋白质正确折叠2) 提高蛋白质的稳定性3)

41、参与细胞粘连（adhesion）4) 参与细胞信号传递2. 糖基化的共同特征：1) 需要酶催化2) 活化的核苷酸（如UDP）糖作为供体分子3) 具有位点特异性3. N-连接寡糖与Asn的侧链中的氨基N相连。发生在Asn-Xaa-Ser/Thr这一特定序列上。其中Xaa可以是除Pro和Asp以外的所有氨基酸。4. N-聚糖可以分为“high mannose type”，“hybrid type”， “complex type”三类。都具有共同的5糖核心：Man（1，6）-（Man（1，3）-Man（1，4）-GlcNAc（1，4）-GlcNAc（1，N）-Asn。5. N-聚糖的三种类型都来自于

42、共同的前体（含有5糖核心），之后再通过修饰产生。6. N-聚糖的前体首先在长萜醇上合成（在RER胞浆面开始，后转移至腔面），之后在转移到肽链上（14糖前体）。（ER）。在高尔基复合体之中可被进一步加工。7. N糖基化的程度取决于可用前体的数目、寡糖酰转移酶的活性、Asn-X-Thr/Ser位点的数目以及其空间可用性。8. 粘蛋白O-连接聚糖（mucin-type O-linked glycans）一般出现在分泌或膜结合蛋白上。9. 粘蛋白O糖基化发生在高尔基体中，将N-乙酰半乳糖胺（连有其他糖）连接到丝氨酸或苏氨酸上。10. 粘蛋白O糖基化的特点：1) 没有特定的氨基酸序列。2) 具有组织特异

43、性。3) 由于发生在蛋白质翻译和折叠的后期，所以只有暴露的丝氨酸/苏氨酸被糖基化4) 在粘蛋白O糖基化中，苏氨酸比丝氨酸糖基化更加高效。11. O糖基化的作用：1) 维持糖蛋白的结构2) 参与细胞识别（ABO血型）3) 调节酶和信号分子的活性4) 参与蛋白表达和加工5) 参与细胞内的相互作用12. O-GlcNAc是广泛存在于核质蛋白上的单糖糖基化。糖基化可逆。N-乙酰-葡萄糖胺酶催化糖基的移除。不识别特定的序列，不过多发生在被激酶识别的位点。不修饰酪氨酸。13. O-GlcNAc可能和磷酸化一起起到调节作用，参与信号转导。涉及转录、翻译、肿瘤、神经病理等生物过程。Chapter 6. Ubi

44、quitinylation and protein degradation1. 蛋白降解的意义：1) 为新蛋白合成提供氨基酸2) 除去过量的酶3) 除去不需要的转录因子2. 溶酶体处理细胞外蛋白和细胞表面膜蛋白（参与受体介导的内吞作用）。3. 蛋白酶体处理内生的蛋白质。如转录因子，周期蛋白，病毒或其他胞内寄生虫的蛋白，错误折叠的蛋白等。4. 蛋白酶体为空心圆柱状，活性中心位于柱内部。包含核心颗粒（20S）和调节颗粒（19S）两部分。核心颗粒具有蛋白酶活性，构成柱身，调节颗粒位于柱两端，识别泛素标记的蛋白，破坏蛋白的三级结构，将其诱导如柱内部核心颗粒除。5. 免疫蛋白酶体具有11S调节颗粒，具有

45、加工I类MHC肽的能力。6. 泛素是含有76个氨基酸的小蛋白质，其序列在整个生物王国中高度保守。被所有生物用来标记需要降解的蛋白质。首先合成一个大的polyprotein，之后在切割为一个个小的泛素。7. 泛素可以一单体存在，也可以与其他泛素形成链状结构。其C端甘氨酸与靶蛋白的赖氨酸侧链形成异肽键。被泛素链标记的蛋白将会被26S蛋白酶体降解。8. 泛素化的过程：a) 泛素的活化：1) E1酶（泛素活化酶）催化ATP水解导致泛素腺苷化，形成Ub-AMP，同时放出PPi。2) 之后，另一个泛素的C端与E1活性位点处的半胱氨酸形成硫酯键。即E1-S-co-Ub.b) 泛素接合ubiquitin co

46、njugation：E1酶以硫酯键结合的泛素被转移到E2酶（泛素接合酶）的半胱氨酸上，形成E2-s-co-Ub。c) 最后，由泛素-蛋白连接酶E3催化E2上的活化泛素转移到蛋白质上。9. 一些蛋白质具有被称为破坏盒（destruction box）的特殊序列，被相应的泛素连接酶识别。10. 多聚泛素一般通过Lys48与Gly76形成异肽键产生。Lys48被半胱氨酸取代导致多聚泛素无法形成将导致蛋白质无法被标记降解。多聚泛素可以在蛋白质上连接形成，也可以先合成好后再连接蛋白质。11. 一般认为，4个泛素连接形成的链能标记蛋白质被26S蛋白酶体水解。12. 除了Lys48外， Lys11和Lys2

47、9形成的多聚泛素也可以标记蛋白质被蛋白酶体水解。而Lys6和Lys63形成的多聚泛素不标记蛋白质降解，但可以改变蛋白质活性和定位。13. 一条多聚泛素链与蛋白质相连足以标记其被降解。多条多聚泛素链与一个蛋白的连接的作用尚不清楚。第一章 绪论1. 传统蛋白质研究技术：测序，需要纯化蛋白质，一个纯化样品只能确定一个蛋白。2. 高通量技术：2D电泳+MS,不需要纯化蛋白质，可以从一个为纯化样品中确认上千个蛋白。3. 蛋白质组学研究是整体， 比较蛋白质的动态变化，研究其相互作用和功能。采用的技术高通量、自动化。而传统蛋白质研究研究的是蛋白质个体，分析其静态性质和结构，采取小规模、非连续的技术。4. 蛋

48、白质组学研究的重要性：1) 蛋白质执行几乎所用生物功能的控制2) 蛋白间的相互作用控制绝大多数细胞发育过程3) 疾病在蛋白质水平上发生并被处理4) 蛋白质是药物的靶点或被制成药物。5. 蛋白质组学的研究角度：1) 从蛋白质化学角度对蛋白质进行研究2) 从生物学角度对差异蛋白质进行研究6. 蛋白质组学研究的内容：1) 特定细胞、组织、器官制造的蛋白质种类2) 明确蛋白质关系网络3) 描绘蛋白质三维结构，确定其结构上的关键部位。7. 蛋白质分离技术：1) 双向凝胶电泳；2) 二维/多维分离技术：亲和色谱、反相色谱、毛细管电泳技术；分离度高、耗样量少、易于与MS连接。3) 蛋白芯片技术。8. 蛋白质

49、分析鉴定技术：生物质谱，基质辅助激光解吸电离MALDI和电喷雾电离ESI。第二章 蛋白质样品制备1. 样品制备原则：1) 使蛋白样品全部处于溶解状态2) 防止样品在聚焦时出现聚集和沉淀3) 防止制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（降解等）。4) 完全除去样品中的核酸，尽量除去干扰蛋白5) 制备方法具有可重现性2. 样品制备步骤：1) 分离：将生物提取液中蛋白与其他物质分开2) 提取：从总的蛋白质溶液中提取目标蛋白3) 纯化：分离出杂质使蛋白质单一化3. 蛋白质分离具体过程：1) Cell washing：需要缓冲液，防止细胞裂解2) Cell disruption3) Removal of c

50、ontaminant4) Microdialysis（微量透析）5) Electrophoretic（电泳的） desalting6) Precipitation（沉淀） methods：原理是加入适当的试剂（硫酸铵、三氯乙酸、丙酮）使蛋白质分子处于等电点或失去水化层，从而使蛋白交替不再稳定，而产生沉淀。可以富集低浓度蛋白，除去杂质同时抑制蛋白酶活性。7) Protease inhibitor：可利用变性剂、低温、高pH等。8) DNA、RNA去除：核酸可被银染，它们造成了在胶中出现水平条纹，它们使蛋白质沉淀，去除：蛋白质沉淀、核酸酶处理、超声波处理、核酸提取（如苯酚）9) 脂质、多糖、固体杂

51、质、盐离子等，洗涤剂、沉淀、离心等10) 微量透析、电洗脱11) 一些不适合，电泳前在低电压下（100V）5小时12) 蛋白质沉淀：聚集蛋白、同时去除多种干扰杂质、蛋白酶活动抑制13) 离心获得蛋白质，但沉淀剂会影响凝胶电泳，会产生修饰14) 原理：加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层，蛋白质的胶体溶液就不在稳定并将产生沉淀。15) 五种方法：硫酸铵、三氯乙酸、丙酮、三氯乙酸/丙酮、醋酸铵16) 抑制蛋白质降解方法17) 强变性剂 (8 molL urea，10TCA或2 SDS) 18) 低温:蛋白酶 低温下无活性 1) 高pH:蛋白酶 pH超过9.0的时候失活。因此，在样

52、品裂解液中出现Tris、碳酸钠和载体两性电解质时也可以抑制蛋白降解4. 从天然物质中提取蛋白质的关键步骤包括：细胞裂解、pH控制、温度控制、避免蛋白降解。5. 样品的溶解是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一，可通过使用变性剂、表面活性剂和还原剂、起载体作用的两性电解质等增加样品溶解性。6. 溶解的目标：1) 破坏样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体，从而形成各个多肽的溶解液。2) 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除。3) 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。7. 亚细胞器的分离可通过差速离心及密度梯度离心。8. 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶

53、解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。9. 用离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行分离。可以减少样品的复杂性，且有利于蛋白质的定位。但需要专业的仪器，可能出现假阳性。10. 细胞分离可以采用激光捕获微解剖的方法。11. 对于高疏水性的蛋白，可以使用硫脲、SDS（紧急情况下，上限2%，需至少稀释SDS样品20倍与尿素折叠，用它的原因：阻止形成低聚物，溶解细胞间质，溶解疏水蛋白），或使用新型的两性离子洗涤剂。12. 低丰度蛋白的分离：除增加上样量和提高总蛋白溶解度外。可采用预分级+窄pH胶的微制备技术进行分离。13. 残留的裂解液、盐离子以及一些内源性的小分子会对蛋白质

54、的分离或电泳产生很大影响，应当尽可能除去。14. 蛋白质含量测定：1) 双缩脲试剂Biuret method（肽键）（紫色双缩脲复合物）（大于1-20mg）2) Lowrys法(Folin-酚试剂法)（氮）与铜在碱性条件下反应，大于0.1mg3) Bradford methods.（考马斯亮蓝）最大吸收峰465-595，大于10-100微克4) 紫外线技术（芳香基团，280nm和200nm光吸收）280nm，大于0.1-1mg5) 特殊技术（蛋白质中的特殊基团，如血红素等）6) 商业化的技术：BCA、DC、DC/RC。7) 出现问题：裂解液影响聚焦（去污剂重泡胀溶液稀释含SDS样品，丙酮沉淀去

55、除SDS，苯酚需要去除）、盐浓度影响（透析、旋转透析、凝胶过滤、沉淀/重悬法脱盐）、内源性小分子影响（核酸，用酶处理，多糖，用硫酸铵、苯酚/醋酸铵沉淀，离心，脂肪，用变性剂和去污剂，不溶物质，去除）第三章 双向电泳技术1. 电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节进行改进，以实现以下目标：1) 提高分辨率及灵敏度2) 简化操作，缩短电泳时间3) 扩大应用范围2. V：泳动速度；d：泳动距离；t：电泳时间；E：电场强度；u：泳动率/泳动度（cm/vs/min）；U：电压；l：电场的长度。3. 电泳类型：1) 区带电泳：支持物为固体，如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、凝胶电泳。2)

56、 自由界面电泳：支持物为溶液，很少用。4. 毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE：单体为丙烯酰胺Acr，交联剂为N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis，加速剂为N,N,N,N-四甲基乙二胺TEMED，催化剂为过硫酸铵AP或核黄素。6. 凝胶电泳的物理效应：样品浓缩效应（凝胶系统的不连续性产生）；分子筛效应；电荷效应。7. 蛋白质的等电点（pI）：当某蛋白质在一定的pH的溶液中，所带的正负电荷相等，它在电场中既

57、不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值叫做该蛋白质的等电点。8. 取决于其氨基酸的组成，是一个物理化学常数。 9. 蛋白质的带电性质与溶液的pH有关10. 不同Pr其aa的数量、种类及占比例不同，pI不同11. 基本原理：利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。12.13. 等电聚焦电泳IEF/EF：在一个稳定的、连续的、（非）线性的pH梯度中根据蛋白质的等电点进行蛋白质的分离和分析。14. 等电聚焦的分辨率用两个邻近带的pI差来表示。其中D是蛋白的扩散系数。分号上方中括号内表示pH梯度；下方中括号内表示蛋白质迁移率的斜率。du/d(pH)是常数。所以只有通过提高场强和使用窄pH范围来提高分辨率。但电压过高会导致产热过多使蛋白质变性甚至烧胶。15. pH梯度的建立：(等电聚焦技术的关键)1) 载体两性电解质pH梯度CA：在电场中通过两性缓冲离子建立的线性pH梯度。2) 固相pH梯度IPG：将缓冲基团共价结合在介质上成为