大赛璐手性分析方法筛选与优化 (2)ppt课件

1、业界之最业界之最享誉全球享誉全球液液- -液萃取法液萃取法生物催化法生物催化法不对称合成法不对称合成法膜分别法膜分别法传感器法传感器法结晶法结晶法毛细管电泳毛细管电泳色谱法色谱法手性分别方法手性分别方法超临界超临界 (SFC) (SFC) 气相色谱气相色谱GCGC 薄层色谱薄层色谱TLCTLC 逆流色谱逆流色谱CCCCCC 模拟挪动床模拟挪动床 (SMB) (SMB) 高效液相色谱高效液相色谱HPLCHPLC 色谱法色谱法方法方法精度精度阐明阐明旋光法旋光法低 (5%) 非对映体异构体法非对映体异构体法高 (0.1%)几十毫克.中等 (2%)几毫克需求位移试剂.色谱法色谱法高高 (0.1%)

2、(0.1%)微克微克- -毫克毫克HPLCHPLC、 、GCGC、 、SFCSFC对映体纯度测定方法及其比较对映体纯度测定方法及其比较几十毫克样品用量样品用量需求其它的手性化合物来制备非对映体需求真实样品手性色谱固定相法根本原理手性色谱固定相法根本原理 操作简单 不需求预处置 准确度高R RR R对映体分别对映体分别表示图表示图S SS SS SS SS SS SS SS SS SS SR,S R,S 消旋体消旋体(racemate)(racemate)手性选择剂手性选择剂R RS SR RR RR RR RR RR RR RR R引入手性环境引入手性环境是实现手性分是实现手性分别的前提别的前

3、提Daicel手性色谱柱一览表手性色谱柱一览表正相正相直链淀粉衍生物直链淀粉衍生物 CHIRALPAK AD / AD-H/AD-3 CHIRALPAK AS / AS-H/AS-3 CHIRALPAK AY-H/AY-3 CHIRALPAK AZ-H/AZ-3纤维素衍生物纤维素衍生物 CHIRALCEL OD / OD-H/OD-3 CHIRALCEL OJ / OJ H/OJ-3 CHIRALCEL OZ H /OZ-3 CHIRALCEL OA, OB, OC CHIRALCEL OF, OG, OK CHIRALCEL CA-1反相反相 CHIRALPAK AD -RH/AD-3R C

4、HIRALPAK AS RH/AS-3R CHIRALCEL OD-RH/OD-3R CHIRALCEL OJ RH/OJ-3R CHIRALPAK AY RH/AY-3R CHIRALCEL OZ RH/OZ-3R其它其它Chiral -AGP CROWNPAK CR (), ()CHIRALPAK OT(), OP ()CHIRALPAK WH, MA ()CHIRALPAK QD-AXCHIRALPAK QN-AX共价键合型共价键合型 CHIRALPAK IA/IA-3 CHIRALPAK IB/IB-3 CHIRALPAK IC/IC-3分析条件优化流程图分析条件优化流程图 (1) (

5、1)酸性酸性中性中性碱性碱性Hex/IPA/TFAHex/IPA/TFA=70/30/0.1=70/30/0.1Hex/IPA/DEAHex/IPA/DEA=70/30/0.1=70/30/0.1Hex/IPAHex/IPA=70/30=70/30碱性碱性样品样品mVMinutes0.01.02.03.04.05.06.07.002468101214161820222410.7413.96Hex/IPA/DEA=90/10/0.1流量：1.0mi/min. 温度：25、检测波长：254流动相Hex/IPA=90/10Hex/IPA/AcOH=90/10/0.1流动相Hex/IPA=90/10-

6、0.10-0.050.000.050.100.150.200.250.300.35mV024681012141618202224262830Minutes10.940.40流量：1.0mi/min.温度：40、检测波长：25405101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52Minutes0.00.20.40.60.81.01.21.41.6mV0510152025303540酸性酸性样品样品FCOOHNH2NON没出峰没出峰 )无法分别无法分别 )*1 主要用于1级胺*2 主要用于1级氨基醇Minutes0.02.55.07.510.0

7、12.515.017.520.0mv020040060080010001200mv020040060080010001200 12.24014.8531: 220 nm, 4 nmRetention TimeMinutes051015mv0100020003000mv0100020003000 1: 220 nm, 4 nmRetention TimeColumn: AY-H (4.6*150mm)Temp: 35Flow:2.0ML/MINMobile phase: CO2/IPA/DEA =85/15/0.1Column: AY-H (4.6*150mm)Temp: 35Flow:1.2M

8、L/MINMobile phase:CO2/IPA/1-propylamine =85/15/0.10.05.010.015.020.025.0min0100200300400mVDetector A Ch1:220nm 2.22529.8790.02.55.07.510.012.515.017.520.0min-250255075100125mVDetector A Ch1:220nm 12.00515.0460.02.55.07.510.012.515.017.5min-50-250255075100mVDetector A Ch1:220nm 12.16414.754Column: OZ

9、-H (4.6*150mm)Temp: 35Flow: 1.0 ml/minMobile phase:hexane/IPA/DEA(75/25/0.1)Column: OZ-H (4.6*150mm)Temp: 35Flow: 1.0 ml/minMobile phase:hexane/IPA/TFA(85/15/0.1)Column: OZ-H (4.6(150mm)Temp: 35Flow: 1.0 ml/minMobile phase:hexane/IPA/TFA/DEA(80/20/O.1/0.05)保保管管时时间间? ?适宜的分析时间(10-30 min.)添加添加 异丙醇异丙醇 添

10、加添加 正已烷正已烷OK!OK!分别？分别？0510152025303540455055600123456789101112131415Minutes4.684.82OB15mV1234567891011121314Minutes6.716.87OD05101520253035404550556065mV0-505101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52AD05101520253035404550556065mV0123456789101112131415OJmV01020304050607080mV0123456789101112

11、13144.7090AS1501020304050607080901000123456789101112131415Minutes4.70OCMinutes1020304050607080mV0123456789101112131415Minutes4.3615OGMinutes001020304050607080mV01234567891011121314Minutes4.36OF色谱条件色谱条件流动相：流动相： Hex./IPA/ AcOH = 90/10/0.1流量流量：1.0ml/min.温度温度 ：40检测波长检测波长 ：UV254nm样品样品：FCOOH选择效果最好的手性柱, 然后

12、继续优化分析条件部部分分分分别别A.A.降低异丙醇降低异丙醇浓浓度度 B. B. 调整温度调整温度C. C. 改换醇类改换醇类05101520253035mV012345678910 11 12 13 14 15Minutes6.667.52在多数情况下，降低醇的浓度可延伸坚持时间，改善分别度在多数情况下，降低醇的浓度可延伸坚持时间，改善分别度Column：AD, Temp.：40, Flow rate：1.0ml/min. Hex./IPA/ AcOH =90/10/0.1Hex./IPA/ AcOH =100/1/0.1-0.50.00.51.01.52.02.53.03.5mV05101

13、5202530354045505560Minutes35.7743.71FCOOHSample：Flurbiprofen部部分分分分别别B. B. 调调整温度整温度C. C. 改换醇类改换醇类A.A.降低异丙醇浓度降低异丙醇浓度Column：CHIRALPAK ADMobile phase： Hex./IPA/ AcOH =90/10/0.1, Flow rate：1.0ml/min. 2540Temp.： 5FCOOH降低柱温可增大降低柱温可增大值，但会使峰形变宽值，但会使峰形变宽升高柱温会减少升高柱温会减少值，但会使峰形尖锋值，但会使峰形尖锋-0.50.00.51.01.52.02.53.

14、03.54.04.55.05.56.00123456789101112131415Minutes8.7212.13:1.59mVMinutes0510152025303501234567891011121314156.667.52:1.23mV01234567890123456789101112131415Minutes7.669.12:1.320.02.55.07.5min-10-505101520mVDetector A Ch1:200nm 3.2173.732Temp.： 25Rs: 1.990.02.55.07.5min0255075mVDetector A Ch1:200nm 4.3

15、355.281Temp.： 20Rs: 2.78Temp.： 15Rs: 3.560.02.55.07.5min010203040506070mVDetector A Ch1:200nm 4.3975.661Column: CROWNPAK CR(+) (4.6*150 mm)Mobile phase: PH=1.0高氯酸高氯酸 Flow: 0.3 ml/minSample: 苏氨酸苏氨酸部部分分分分别别C.C.改改换换醇醇类类B. B. 调整温度调整温度A.A.降低异丙醇浓度降低异丙醇浓度由异丙醇换为乙醇由异丙醇换为乙醇-选择性增大选择性增大Hex./IPA/AcOH=90/10/0.1FC

16、OOHIPA和和EtOH有时会使峰形和有时会使峰形和值发生明显变化值发生明显变化Column：CHIRALPAK ADTemp.：40, Flow rate：1.0ml/min. Sample：Flurbiprofen05101520253035mV0123456789101112131415Minutes6.667.52 =1.2305101520253001234567891011121314157.589.64 =1.45mVMinutesHex./EtOH/AcOH=95/5/0.10.05.010.015.020.025.0min0255075100mVDetector A Ch2:

17、254nm 20.24121.4240.02.55.07.510.012.515.0min050100150200250300mVDetector A Ch2:254nm 10.01113.410Column: AY-H (4.6X250mm)Temp: 35Flow:1.0 ml/minMobile phase:hexane/IPA/DEA(90/10/O.1)Column: AY-H (4.6X250mm)Temp: 35Flow:1.0 ml/minMobile phase:hexane/EtOH/DEA(90/10/O.1)01020min0250500mVDetector A Ch1

18、:220nm 0.05.010.0min0250500750mVDetector A Ch1:220nm 8.47511.818IA-H80I20DEA0.1-1.0mlmin-35IA-M100DEA0.1-1.0mlmin-350.02.55.07.510.012.515.017.5min-50-250255075100mVDetector A Ch1:220nm 12.16414.7540.02.55.07.510.012.5min050100150200250300350mVDetector A Ch1:214nm 5.0117.462OZ-H， ，Hexane/IPA /TFA/DE

19、A= 80/20/0.1/0.05 v/v/v)， ，1.0 ml/min OZ-H， ，MeOH/DEA=100/0.1 v/v)， ，0.8 ml/min CHIRALPAK IA/IB/ICCHIRALPAK IA/IB/IC研发背景研发背景CHIRALPAK IA, IB, ICONHCH3CH3OROOROROnROROOROROnONHCH3CH3RONHClClROROOROROnCHIRALPAK IACHIRALPAK IBCHIRALPAK ICNew!l 流动相组分没有任何限制流动相组分没有任何限制l 可以选用任何有机溶剂溶解样品可以选用任何有机溶剂溶解样品l 新的手性选

20、择性新的手性选择性l 可以再生，寿命长可以再生，寿命长l 正相与反相可以在同一支柱子上实现正相与反相可以在同一支柱子上实现对于一些化合物，分对于一些化合物，分别度能够优于涂布型别度能够优于涂布型0.02.55.07.5min0250500750mVDetector A Ch1:220nm 0.01.02.03.04.05.0min0250500750mVDetector A Ch1:220nm 分别度优于涂布型分别度优于涂布型实例实例Column: AD-H (4.6X250mm)Temp: 35Flow:1.0 ml/minMobile phase: hexane/IPA/DEA (90/1

21、0/0.1)Column: IA (4.6X150mm)Temp: 35Flow:1.0 ml/minMobile phase: hexane/IPA/DEA (90/10/0.1)0.02.55.07.510.0min0250500750mVDetector A Ch1:220nm 0.02.55.07.5min050100150200mVDetector A Ch1:220nm 3.9445.528由于在流动相中改善了由于在流动相中改善了溶解度，柱效优于涂布溶解度，柱效优于涂布型型Column: AD-H (4.6X250mm)Temp: 35Flow: 1.0 ml/minSolubil

22、ity: 0.5 mg/mlMobile phase: hexane/IPA (70/30)Column: IA (4.6X250mm)Temp: 35Flow: 1.0 ml/minSolubility: 7.0 mg/mlMobile phase: MtBE/MeOH (80/20)更高的柱效，更好的更高的柱效，更好的峰形峰形Chromatographic Condition: Hexane/IPA, 90/10 (v/v)经过溶剂多样性优化手性分别经过溶剂多样性优化手性分别IBIB含水流动相含水流动相非水与水相体系通用非水与水相体系通用CH3NNOCH302468101250100150

23、200250300a= 2.810 0101020200.000.000.010.010.020.020.030.030.040.040.050.05a= 2.36a= 1.960 01 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111 12121313 14140 00.10.10.20.20.30.30 02 24 46 68 81010121214140.00.00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0a= 1.790 0101020200.000.000.010.010.020.020.030.030.040.04a= 1.700246810121

24、4050100150200250a= 1.650 0101020200.00.00.10.10.20.2a= 1.63a= 1.330 02 24 46 68 81010121214140.00.00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.0修复再生后修复再生后可运用各种强极性溶剂可运用各种强极性溶剂柱性能受损柱性能受损 如受强吸附杂质的影响如受强吸附杂质的影响OOFOOHOH样品样品新色谱柱新色谱柱 IA柱的修复再生方法：第一：第一：EtOH 0.4ml/min 30minEtOH 0.4ml/min 30min第二：第二：DMF 0.3ml/min 3hDMF 0.3ml/

25、min 3h第三：第三：EtOH 0.3ml/min 50minEtOH 0.3ml/min 50min第四：第四：H/E=90/10H/E=90/10还不行，再用下面条件还不行，再用下面条件第一：第一：EtOH 0.4ml/min 30minEtOH 0.4ml/min 30min第二：第二：THF 0.5ml/min 2hTHF 0.5ml/min 2h第三：第三：EtOH 0.4ml/min 30minEtOH 0.4ml/min 30min第四：第四：DMF 0.3ml/min 3hDMF 0.3ml/min 3h第五：第五：EtOH 0.3ml/min 50minEtOH 0.3ml

26、/min 50min第六：第六：H/E=90/10H/E=90/10 IB IC柱的修复再生方法：第一：第一：EtOAc EtOAc 1ml/min 1ml/min 30min30min，有添加，有添加剂的剂的2h, 2h, 室室温保管温保管2 2天天第二：第二：H/I=90/10 H/I=90/10 1ml/min 1h1ml/min 1h键合型固定相挑选普通流程键合型固定相挑选普通流程l 选用比较典型的溶剂组协作为起始挑选流动相选用比较典型的溶剂组协作为起始挑选流动相l Hexane/IPA Hexane/IPAEtOHEtOH Hexane/THF(DCM, EA) Hexane/THF

27、(DCM, EA) l MtBE/ MeOH (IPA,EtOH MtBE/ MeOH (IPA,EtOH MtBE/ THF(DCM, EA) MtBE/ THF(DCM, EA) l ACN/ MeOH (IPA,EtOH ACN/ MeOH (IPA,EtOHl 假设分析物的溶解度不好，优先选用溶解度好的有机溶剂作为流动相组分假设分析物的溶解度不好，优先选用溶解度好的有机溶剂作为流动相组分l 运用多元流动相优化分别运用多元流动相优化分别OD-RH1054027OJ-RHAS-RH540*229*2,3AD-RH新新产产品：品： AY-RH / OZ-RH根据样品性质选择流动相根据样品性质

28、选择流动相样品性质OD-RH、OJ-RHAD-RH、AS-RH中性水/乙腈酸性磷酸水溶液(pH2)/乙腈0.1M 磷酸缓冲液(pH2)/乙腈碱性0.1M KPF6 水溶液/乙腈0.1M NaPF6水溶液/乙腈20mM 硼酸缓冲液(pH9)/乙腈20mM 磷酸缓冲液(pH8)/乙腈反相流动相的反相流动相的pH值对分别度的影响值对分别度的影响 (AS-RH )OOH中性化合物BenzoinONHOCO OH酸性化合物N-CBZ-Norvaline碱性化合物Ofloxacin ethyl esterONNNFOCO OEt水溶液水溶液/CH3CN=60/40流速：1.0ml/min.水溶液/CH3C

29、N=60/40流速：1.0ml/min.水溶液/CH3CN=80/20流速：0.5ml/min.051015mV02468101214Minutes7.168.77024681012mV0123456789 10Minutes2.250.01.02.03.04.0mV0 5 1015202530354045505560Minutes27.79水磷酸水溶液(pH2)硼酸缓冲液(pH9)051015mV02468101214Minutes7.118.7005101520mV0.02.04.06.08.0Minutes4.174.69020406080mV0 5 101520253035404550

30、5560Minutes4.004.484.77051015mV02468101214Minutes6.978.53010203040506070mV0123456789 10Minutes1.850.02.04.06.08.00 5 1015202530354045505560Minutes30.7436.78有机溶剂种类对分别的影响有机溶剂种类对分别的影响12.1813.548.208.8411.5212.358.2114.1215.787.457.97水水/乙腈乙腈=50/50水水/乙醇乙醇=35/65水水/甲醇甲醇=25/75OOH2-Methyl-1-tetralone2-Phenyl

31、-2-butanol 手性柱：手性柱： CHIRALPAK AD-RH 、流速：、流速：0.5ml/min、温度：、温度：25反相柱分析条件优化的总结反相柱分析条件优化的总结有机溶剂的种类不同，其洗脱强度也不同。有时其分有机溶剂的种类不同，其洗脱强度也不同。有时其分别效果也发生一些变化别效果也发生一些变化手性色谱柱组合挑选手性色谱柱组合挑选组合挑选设备组合挑选设备IPA泵泵紫外检测器紫外检测器色谱柱自动切换阀色谱柱自动切换阀流动相流动相2自动进样器自动进样器组合挑选设备表示图组合挑选设备表示图流动相流动相1溶剂切换阀溶剂切换阀旋光检测器旋光检测器串联旋光检测器的益处串联旋光检测器的益处 11.

32、1.用用UVUV检测器只出现检测器只出现“峰的时候峰的时候 运用旋光检测器可确认其分别情况运用旋光检测器可确认其分别情况2. 2. 可确可确认认洗脱洗脱顺顺序序串联旋光检测器的益处串联旋光检测器的益处 2假设挑选没得到理想的分析条件时假设挑选没得到理想的分析条件时Daicel大部分手性柱是涂敷型产品，在市场上具有独特性。大部分手性柱是涂敷型产品，在市场上具有独特性。假设导入错误的溶剂假设导入错误的溶剂(CH2Cl2、乙酸乙酯、甲苯等、乙酸乙酯、甲苯等)，柱子会马上被破，柱子会马上被破坏。坏。当流动相或样品溶液导入错误的溶剂时，柱压剧增，分别忽然变差。当流动相或样品溶液导入错误的溶剂时，柱压剧增，分别忽然变差。一旦