生物技术前沿生物技术李志伟

1、单克隆抗体的定义单克隆抗体的定义单克隆抗体简介单克隆抗体简介单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用单克隆抗体的研究进展单克隆抗体的研究进展单克隆抗体的定义单克隆抗体的定义单克隆抗体单克隆抗体由单一由单一B细胞细胞克隆产生的高度均克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏泌特异性抗体能力的致敏B细胞细胞

2、和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为胞融合为B细胞杂交瘤。用具备细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。表位的特异性抗体即单克隆抗体。单单克克隆隆抗抗体体简简介介1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作

3、单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程免疫免疫动物动物细胞细胞融合融合选择选择性培性培养养 杂交瘤阳性杂交瘤阳性克隆的筛选克隆的筛选与克隆化与克隆化单克隆抗体单克隆抗体的大量制备的大量制备单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程1 1、免疫动物、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致免

4、疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏敏B B淋巴细胞的淋巴细胞的 过程。过程。 一般选用一般选用6-86-8周龄雌性周龄雌性BalbBalb/c /c小鼠，按照小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应循环进入外周免疫器官，刺激相应B B淋巴细胞克隆，使其活化、淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏增殖，并分化成为致敏B B淋巴细胞。淋巴细胞。2 2、细胞融合、细胞融合 采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，

5、制备脾细胞悬液。在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。形成杂交瘤细胞。3 3、选择性培养、选择性培养 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用一般采用HATHAT选择性培养基。在选择性培养基。在HATHAT培养基中，未融合的骨髓培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤瘤细胞因

6、缺乏次黄嘌呤- -鸟嘌呤鸟嘌呤- -磷酸核糖转移酶，不能利用补磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成救途径合成DNADNA而死亡。而死亡。 未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤- -鸟嘌呤鸟嘌呤- -磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。渐死亡。 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在因此能在HATHAT培养基中存活和增殖培养基中存活和增殖

7、。单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程4 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在在HATHAT培培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定

8、其所分泌单克隆抗体的扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。存。5 5、单克隆抗体的大量制备、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养量制备重要采用动物体内诱生法和体外培养法。法。单克隆抗体的单克隆抗体的应用应用检验医学诊断试剂检验医学诊断试剂蛋白质的提纯蛋白质的提纯肿瘤的导向治疗和放射肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术免疫显像技术单单克克隆隆抗抗体体的的研研究究进进展展单克隆抗体药物的发展起源于

9、1975年,杂交瘤技术的问世使大量制备均一的鼠源单克隆抗体成为可能。1986年第一个抗移植后免疫排斥反应的鼠源单克隆抗体muromonab-CD3(OKT3)经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准上市，但是来源于鼠源淋巴细胞杂交瘤的抗体被人的免疫系统识别，会引起严重的人抗鼠抗体反应（human anti-mouse antibody,HAMA）,不仅使治疗性单抗半衰期变短，疗效减弱，有时还会引起严重的不良反应。单克隆抗体药物的发展在1988年到1993年间陷入低谷。随着重组DNA技术的发展，各种抗体人缘化技术迅速发展，单克隆抗体药物经

10、历了人鼠嵌合单抗、人源化单抗阶段。随后出现的噬菌体展示文库技术和转基因小鼠技术，使全人源单抗的产生成为可能,2002年第一个全人源抗体阿达木单抗上市。单克隆抗体在医药治疗上有广泛的前景，被用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。6 阿达木用于缓解抗风湿性药物(DMARD)治疗无效的结构性损伤的中至重度类风湿关节炎(RA)。THE END单克隆抗体的定义单克隆抗体的定义单克隆抗体简介单克隆抗体简介单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用单克隆抗体的研究进展单克隆抗体的研究进展单单克克隆隆抗抗体体制制备备过过程程4 4、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 在在HATHAT培培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的扩增。经过全面鉴定其所分泌单克