何首乌提取物聚酰胺柱层析流分促血管内皮细胞生长活性研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减何首乌提取物聚酰胺柱层析流分促血管内皮细胞生长活性研究（作者：单位：邮编：）【摘要】目的初步探讨何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响。方法MTT比色法检测何首乌提取物聚酰胺柱层析流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的促进作 用；HE染色法观察其流分对人脐静脉血管内皮细胞形态学的影响。 结果经聚酰胺柱层析洗脱的何首乌流分对人脐静脉血管内皮细胞增 殖具有不同的作用，其中 D流分随着浓度的增加，对人脐静脉血管 内皮细胞增殖具有促进作用，显微镜下观察到细胞的数量及分裂相增 多，B和C流分对细胞的增殖影响不大，而 A流分对血管内皮细胞 具有抑制生长作

2、用，细胞的数量减少，核固缩。结论何首乌提取物聚 酰胺柱层析流分中含有促人脐静脉血管内皮细胞生长的活性物质。【关键词】 何首乌 聚酰胺柱色谱 人脐静脉血管内皮细胞 MTT比 色法HE染色法Abstract:ObjectiveTo investigate the proliferation effects onhuman umbilical vein vascular endothelial cells(HUVECs)of thefractio ns isolated from Polyg onum multiflorm Thunb extracted with polyamide colu mn

3、 chromatography. MethodsThe activity of promoti ng HUVECs growth of each fracti on was observed by MTT colorimetric assay. The changes of HUVECs morphology were observed by HE stai n. ResultsThe fractio ns eluted from polyamide column chromatography had different proliferation activities on HUVECs.

4、With the in crease of concen trati on, the fracti on D couldpromote the growth and proliferati on of HUVECs sig nifica ntly. The cells showed morphological cha nge sig nifica ntly un der microscope. Compared with the control , the cell quantity and mitosis of the fracti on D were in creased. However

5、, there was little or no effects on the proliferation of HUVECs by fraction B and C. In contrast, fraction A had an inhibitory effect on the growth of HUVECs , which caused the decrease in the cell nu mber and karyopyc no sis. Con clusi on There are some comp onents of promoti on growth of HUVECs in

6、 the fracti on from polyg onum multiflorm Thunb.Key words: Polygonum multiflorm Thunb. ; Polyamide colu mn chromatography ; Huma n umbilical ve in vascular endothelial cell(HUVEC) ; MTT colorimetric assay ; HE stain何首乌 Polygo num multiflorm Thu nb.系蓼科植物何首乌的干燥块根，具有乌须发、悦颜色、补肝肾、抗衰老之良效1 。现 代药理学研究表明其醇提或水

7、提液具有提高免疫力、抑制血小板聚 集、舒张血管、抗氧化等作用，且这些作用与其中的活性成分二苯乙 烯苷（2,3,5,4 / -tetrahydroxy-stilbene-2-O-伕D-glucoside ）有关1,2。二苯乙烯苷又称芪多酚，属多羟基芪类化合物，现代药理学研究 表明，其具有清除自由基2、降低胆固醇3、保护肝脏等4 作用。本实验采用MTT法和HE染色法观察何首乌提取物聚酰胺柱 层析流分对人脐静脉血管内皮细胞增殖的影响，为何首乌的进一步开发和利用提供依据。1材料与仪器1.1材料聚酰胺（6080目）和聚酰胺薄膜（10 cm X10 cm ）购于浙江 省台州市路桥四甲生化塑料厂；何首乌饮片

8、购自广西医药公司；人脐 静脉血管内皮细胞购自武汉大学保藏中心。1.2仪器RE-52型旋转蒸发仪（上海博通）;SHB-皿循环水式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司）；紫外线检出器（日本）；二氧化碳培养箱 （Thermo Forma MODEL 3111） ； I960酶标仪；倒置相差荧光显微镜（Olympus CXZIFSZ ）；生物显微镜（日本 Olympus ）。1.3试剂乙醇；丙酮；甲醇（成都市科龙化工）；冰乙酸（上海实 意化学试剂有限公司）；无水乙醇（重庆川江化工）；氯仿（广东省化学 试剂工程技术研究开发中心）,以上试剂级别均为分析纯。RPMI1640 培养基（GIBCO Invitr

9、ogen cooperation ）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）自配试剂：2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色剂；0.5%胰蛋 白酶溶液；PBS ;苏木精染液；伊红染液及1%稀盐酸乙醇溶液。2方法2.1何首乌流分提取分离取2 kg何首乌粉用4倍量70%乙醇 回流提取，浓缩后的总浸膏依次采用环己烷、醋酸乙酯、正丁醇分别 进行萃取。采用聚酰胺柱层析法，以蒸馏水 -乙醇为洗脱剂对正丁醇 层浸膏进行分离，收集各流分；点样，在 365 nm处用紫外灯观察， 并以2%三氯化铁-2%铁氰化钾显色跟踪检测，合并相同流分，减压 浓缩。按洗脱顺序分别得到 A，B，C，D流分组。2.2活性研究2.2.1

10、细胞的培养人脐静脉血管内皮细胞培养于含体积分数为10%热灭活新生牛血清的培养液中，置二氧化碳培养箱，在37 C, 5 % CO2条件下培养。2.2.2 MTT法测定细胞生长增殖实验取指数生长期细胞用 0.5% 胰蛋白酶消化，加入含小牛血清的培养液计数并稀释至 1 X104个/ml。 将稀释的细胞悬液按100山孔接种至96孔板，置37 C ,5%CO2培养 箱中孵育24 h至细胞贴壁后，选择A，B，C，D 4种流分，每组设5 个浓度梯度加入至96孔板中，每个浓度设3个平行孔。同时设PBS 空白对照组6孑L，继续培养72 h,取出孔板，每孔加入20山5 mg/ml 的MTT,37 C、5%CO2条

11、件下孵育4 h,弃尽孔内液，每孔中加入200卩 I的DMSO溶解MTT产物。振荡30 s，用酶标仪于490 nm处测定 每个孔的吸光值A值。计算存活率：细胞存活率（）=（用药组平均A 值/对照组平均A值）X100%223 HE染色法观察流分对人脐静脉血管内皮细胞形态的影响取贴壁生长的细胞，用0.5%胰蛋白酶消化，加入含小牛血清 的培养液计数并稀释至1 X104个/ml。将稀释的细胞悬液按2 ml/孔 接种至6孔板，加入已高压灭菌的盖玻片，培养 24 h后，加入不同 浓度的流分，药物组设定如下：A流分组、D流分组，每组设两个浓 度梯度，每个浓度设2个平行孔；同时设2孔空白对照组。培养24 h 后

12、，取出盖玻片。用95 %乙醇固定，苏木精及伊红染色，乙醇脱水， 二甲苯透明，最后用中性树胶封片，摄像。3结果3.1 MTT实验结果不同浓度的流分分别作用于人脐静脉血管内皮细胞后，采用MTT法测定其对细胞生长的作用。其中流分 D对人 脐静脉血管内皮细胞的生长具有促进作用，出现明显的量效关系，即浓度越高，存活率越高。流分 A对人脐静脉血管内皮细胞具有一定 的抑制生长作用。流分B，C与对照组比较，基本无差异。结果见表 1。表1何首乌提取物4种流分对人脐静脉血管内皮细胞生长的作用（略）3.2细胞形态学改变经HE染色后显微镜观察，可见正常的人 脐静脉血管内皮细胞呈梭形，细胞浆丰富，均匀，细胞核规则，呈紫

13、蓝色，核内染色均一。A流分组对细胞具有抑制作用，光镜下观察到 细胞的数量减少，部分细胞特别是高浓度组出现胞浆减少， 核固缩现 象。D流分组对细胞具有明显的促进生长作用， 尤其是高浓度组表现 为细胞生长旺盛，核分裂相增多，细胞数量增多。见图1。4讨论聚酰胺是通过己内酰胺聚合而成的尼龙-6 （锦纶、卡普隆） 及由己二酸与己二胺聚合而成的尼龙-66，是一种白色多孔非晶型粉 末，其分子中含有丰富的酰胺基，可与多酚类化合物的羟基（或羧基） 形成分子间氢键而将其吸附。分子中酚羟基数目越多，芳香化程度越 高的化合物与酰胺基的结合力越强，从而实现与其它物质的分离5 结合本文MTT法结果可以知道，较晚洗脱出来的

14、流分 D，对人脐静 脉血管内皮细胞具有促进增殖生长作用，推测流分D中促进血管内皮细胞生长的物质可能与含有酚羟基数目较多有关。但要确定酚羟基是否为促人脐静脉血管内皮细胞生长的药效团有待进一步研究。血管内皮细胞在维持血管张力和血流调节方面发挥重要作 用，内皮细胞还可以阻止血小板和白细胞的激活，所以完整的内皮系统在维持血管稳定和防止血栓方面发挥重要作用。临床实践证实中药何首乌提取物对生物体多种代谢活性具有积极的影响作用。 本实验结 果表明，在何首乌醇提物的正丁醇萃取物中含有对血管内皮细胞增殖 产生促进作用的活性物质，可使细胞的分裂相增多，染色质丰富，为 进一步从何首乌中分离纯化具有保护和修复血管内皮

15、细胞的活性物 质提供了依据。【参考文献】:1李玉芳，何玄华.何首乌现代研究进展J 中成药,1997,19(5):37.2 Ryu G , Ju JH , Park YJ,et al. The radical scavengingeffects of stilbene glucosides from Polygonum multiflorumJ .ArchPharm Res , 2002, 25(5):636.3 Arichi H, Kimura Y, Okuda H,et al. Effects of stilbene comp onents of the roots of Polyg onum cuspidatum Sieb. et Zucc.on lipid metabolism J .Chem Pharm Bull (Tokyo). 1982