淀粉液化及糖化实验

1、淀粉液化及糖化实验、实验目的1. 掌握用酶解法从淀粉原料到水解糖的制备原理及方法；2. 掌握复原糖的测定方法。二、实验原理在发酵过程中，因有些微生物不能直接利用淀粉，当以淀粉为原料时，必须先将淀粉 水解成葡萄糖，才能供发酵使用。一般将淀粉水解为葡萄糖的过程成为淀粉的糖化，所制 得的糖液成为淀粉水解糖。水解淀粉为葡萄糖的方法包括酸解法、酸酶结合法和酶解法。 实验室常采用酶解法制备淀粉水解糖。酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法葡萄糖可分为两步：第一 步是利用a-淀粉酶将淀粉转化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液 化；第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变

2、为葡萄糖的过程，这个过程在 生产上成为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故该方法也称为双酶法。1. 酶解法液化原理淀粉的酶解法液化是以a -淀粉酶作为催化剂，该酶作用于淀粉的a -1,4-糖苷键，从 内部随机地水解淀粉，从而迅速将淀粉水解为糊精及少量麦芽糖，所以a -淀粉酶也称内切淀粉酶。淀粉受到 a-淀粉酶的作用后，其碘色反响发生以下变化：蓝色f紫色f红色 浅红色不显色即显碘原色。酶解法液化因生产工艺不同分为间歇法、半连续法和连续法；液化设备分为管式、罐 式和喷射式；加酶方法包括一次加酶法、二次加酶法和三次加酶法；根据酶制剂的耐温性分为中温酶法、高温酶法及中温酶和高温酶混合法。本

3、实验采用：高温酶法，间歇式，罐 式，一次加酶法2. 酶解法糖化原理淀粉的酶解法糖化是以糖化酶为催化剂，该酶从非复原末端以葡萄糖为单位依次分解 淀粉的a -1,4-糖苷键或a -1,6-糖苷键，由于是从链的一端逐渐一个个地切断为葡萄糖, 所以糖化酶也成为外切淀粉酶。淀粉糖化的理论收率：因为在糖化过程中有水的参与反响，故糖化的理论收率为111.1%(C6HioQ) n +H2O f n C6H12Q162 18 180淀粉糖化实际收率的计算公式:X100%糖液量L X糖液葡萄糖含量g/L投入淀粉量g X原料中纯淀粉含量淀粉转化率是指100份淀粉中有多少份淀粉被转化为葡萄糖淀粉转化率的计算:X100

4、%糖液量L X糖液葡萄糖含量g/L投入淀粉量g X原料中纯淀粉含量 X1.11糖化液中复原糖以葡萄糖计占干物质的百分比，称为DE值。用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度DE值的计算公式:D匚值=复原糖含量=干物质含量x 100%复原糖含量用3,5-二硝基水杨酸DSN比色法测定，表示方法：g葡萄糖/100mL糖 液。干物质含量用阿贝折光仪测定，表示方法：g干物质/100mL糖液。本实验采用淀粉干 重替代即原料中纯淀粉含量为100%。糖化时间与糖化酶用量的关系见表 1。表1糖化时间与糖化酶用量关系表糖化时间/h68101624324872糖化酶用量U/g 淀粉4804003202401801501

5、20100三、实验仪器与试剂1. 仪器分光光度计、恒温水浴锅、烘箱、滴定管、酸度计、电炉、离心机、白瓷板、烧杯、试管等。2试剂玉米淀粉、a -淀粉酶、糖化酶、PH试纸、盐酸、葡萄糖溶液、DNS式剂、无水酒精等。磷酸-柠檬酸缓冲液PH6.0:称取磷酸氢二钠NqHPQ 12HO 45.23 g，柠檬酸C6HO - H2O 8.07 g,用蒸馏水溶解定容至1000 mL配好后应以酸度计调整PH值为6.0原碘液存储液：称取0.5 g碘和5.0 g碘化钾，研磨，溶于少量蒸馏水中，然后定 容至100 mL，储存于棕色瓶中备用。稀碘液工作液：取1 m/L原碘液用蒸馏水稀释100倍当天制备。反响终止液：0.1

6、 mol/L硫酸。四、实验方法1. 淀粉的液化配置30%勺淀粉乳按照0.1 L配制两份，调节PH值至6.5，参加氯化钙固形物 0.2%，钙离子的存在可以保持 a -淀粉酶在水解过程中保持活力和稳定性，参加a -淀粉 酶1220 U/g淀粉；在剧烈搅拌下，先加热至 72 C,保温15 min ;再加热至90 C, 并维持30 min，中间不停止搅拌，以到达所需的液化程度DE值1518%;取小样检测碘 色反响呈棕红色；液化反响后，再升温至100120 C,保持58 min，以凝聚蛋白质；以6000 r/min 离心5 min得到上清液。2. 淀粉的糖化迅速将上述上清液用盐酸将 PH调至4.24.5

7、，同时迅速降温至60 C；然后参加糖化 酶酶活力为10000 U的酶液0.5 mL，于60 C保温12 h ;当用无水酒精检验无糊精存 在时，将溶液PH值调至4.85.0，同时，将溶液加热至80 C,保温20 min ;然后将溶液 温度降至6070 C，以6000 r/min 离心5 min即得到糖上清液；量取该糖液体积，取样 分析复原糖含量测定方法参见附录“葡萄糖含量的测定3,5-二硝基水杨酸比色法相 关内容。五、实验结果1. 在详细记录实验数据根底上完成下表，计算淀粉转化率(1)葡萄糖含量测定 吸光度测定试剂试管编号0123451mg/mL葡萄糖溶液00.20.40.60.81.0(mL蒸

8、馏水(mL1.00.80.60.40.20DNS试剂(mL333333吸光度 标准曲线绘制 葡萄糖含量计算(2)淀粉转化率测定淀粉量纯淀粉含量糖液量糖液葡萄糖含量糖化实际淀粉转化(g)(%(L)(g/L)收率率(%(%100六、实验思考1. 分析糖化酶用量对糖化效果的影响？2. 淀粉液化过程中几个保温过程有何作用?附录1葡萄糖含量的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验原理本实验是利用3,5-二硝基水杨酸DNS试剂与复原糖溶液共热后被复原成棕红色的 氨基化合物，在一定范围内复原糖的含量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系， 故可用于比色测定。葡萄糖与 3,5-二硝基水杨酸试剂反响生成的有色

9、物质在540 nm波长下有最大吸收峰，故在此波长下进行比色测定。二、实验方法1.标准曲线的绘制取6支大试管，分别编号05,按下表1参加各种试剂表1葡萄糖含量的测定试剂试管编号0123451mg/mL葡萄糖溶液00.20.40.60.81.0(mL蒸馏水mL1.00.80.60.40.20DNS试剂mL333333将各试管中溶液振荡均匀后，在沸水浴中准确煮沸5 min，将试管取出迅速用冷水冷却至室温，参加蒸馏水15 mL，摇匀。在540 nm波长下，用0号试管作为空白调零，测定其他试管内溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线2. 样品的测定将发酵液5 mL,以5000 r/min离心5 min，取上清液1