《电泳技术方王楷》ppt课件

1、电泳电泳electrophoresis电泳的根本原理电泳的根本原理带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向挪动的景象称为电泳。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分挪动的间隔不同，从而到达分别鉴定各组分的目的。 n在电场中，推进带电质点运动的力F等于质点所带净电荷量Q与电场强度X的乘积。 FQX n n质点的前移同样要遭到阻力 f 的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：f 6 r r为质点半径，为介质粘

2、滞系数，为质点挪动速度 n当质点在电场中作稳定运动时：F f 即：QX6r 迁移率u：单位电场强度下的电泳速度， 粒子的迁移率在一定条件下决议于粒子本身的性质即其所带电荷及大小和外形。uv/E=q/6r v=QX /6r 在详细实验中，挪动速度V为单位时间t单位为s内挪动的间隔d单位为cm，即Vd/t。电场强度X为单位间隔L单位为cm内电势差E单位为伏特，即XE/L。将这两个公式代入上述公式，得到U=v/X=dL/Et d=u*Et/L由此可以得到两种物质挪动间隔的差为 d=(dA-dB)=(uA-uB)Et/L从这个公式可以看出物质能否进展分别决议于二者的迁移率。 影影 响响 因因 素素1.

3、 1. 待分别大分子的性质待分别大分子的性质 ：所带的电荷、分子大小和外形，分子带的电：所带的电荷、分子大小和外形，分子带的电荷量越大、直径越小、外形越接近球形，那么其电泳迁移速度越快荷量越大、直径越小、外形越接近球形，那么其电泳迁移速度越快 2. 2. 缓冲液缓冲液pHpH和离子强度：和离子强度：pHpH值间隔其等电点愈远，其所带净电荷量就值间隔其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大越大，电泳的速度也就越大 ；但是；但是pHpH过高或过低引起蛋白变性，缓过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要坚持一定的离子强度；强度过低，那么缓冲才干差，不冲液通常要坚持一定的离子强度；强度过低，

4、那么缓冲才干差，不易维持易维持PHPH恒定，离子强度过高，在待分别分子周围构成较强的带相恒定，离子强度过高，在待分别分子周围构成较强的带相反电荷的离子分散层即离子氛，降低了蛋白质的带电量，使电反电荷的离子分散层即离子氛，降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。普通所用离子强度为泳速度减慢。普通所用离子强度为0.02-0.20.02-0.2之间。之间。3. 电场强度：过高，产热，样品和电场强度：过高，产热，样品和Buffer分散添加，条带分散添加，条带增宽；蛋白变性。过低，电泳时间添加，分散。当需求增宽；蛋白变性。过低，电泳时间添加，分散。当需求增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却安装增大电场

5、强度以缩短电泳时间时，需附有冷却安装4. 电渗电渗 ：在：在 电场中液体对固体支持物的相对挪动；当电渗电场中液体对固体支持物的相对挪动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。5. 支持介质的筛孔支持介质的筛孔 ：筛孔越小，那么颗粒在挪动的过程中：筛孔越小，那么颗粒在挪动的过程中所遭到的阻力也就越大所遭到的阻力也就越大分分 类类按支持介质的不同可分为： 纸电泳Paper electrophorisis 醋酸纤维薄膜电泳Cellulose Acetate el

6、ectrophoresis 琼脂凝胶电泳Agar Gel electrophoresis 聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel electrophoresisPAGE SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSPAGE。按支持介质外形不同可分为： 薄层电泳 ； 板电泳 ； 柱电泳 聚丙烯酰胺电泳聚丙烯酰胺电泳PAGE聚丙烯酰胺凝胶由单体丙稀酰胺和 N,N-甲叉双丙烯酰胺在加速剂和催化剂（四甲基乙二胺，TEMED）作用下交联成三维网状结构的凝胶。具有如下优点： 1、一定浓度下，凝胶透明，有弹性，机械性能好 2、化学性能稳定，与被分离物不起化学反应 3、对 pH 和温度变化较稳定 4、几乎无

7、电渗作用，样品分离重复性较好 5、样品不易扩散，用量少，灵敏度可达 106g 6、凝胶孔径可调节 7、分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中 不连续凝胶电泳的分离原理： 1、样品的浓缩效应 1）凝胶层的不连续性 2）缓冲液离子成分的不连续性 2、电荷效应 各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率也不同 3、分子筛效应 凝胶浓度不同， 网孔径大小不同。 分子量和构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，引起泳动速度的变化，从而达到分离目的。 影响因素： 1、聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小 2、缓冲系统 3、离子强度 血血 清清 蛋蛋 白白 醋醋 酸酸 纤纤 维维 薄薄 膜膜 电电 泳泳n目的：n1.

8、掌握醋酸纤维膜电泳的根本原理及其临床意义n2.熟习电泳仪器的运用和操作n原 理：n 血清蛋白在pH8.6的巴比妥缓冲液中以负离子方式存在，分子大小、外形各有差别。在电场作用下，可在醋酸纤维膜上分别成。A、1、2、五条区带。电泳终了后，将醋酸纤维膜置于染色液。使蛋白固定并染色，再脱色洗去多余染料。将染色后的区带分别剪开，将其溶与碱液，进展比色测定，计算各区带的百分数。实验操作步骤及留意点实验操作步骤及留意点1、预备与点样 1 将已充分浸透的醋酸纤维膜取出，用滤纸吸去多余的缓冲液。在膜的无光泽面距一端 2cm 处点样膜不能折；在膜上标志记号。 2用点样器蘸血清少许 不能看见有液滴构成 ，按在点样处

9、点样要与膜边缘垂直，且大小均匀。 2、电泳 将膜无光泽面向下，点样端置于阴极，膜与电极严密接触不能留有气泡，平衡5min。通电，电压100V,时间1 h 。 3、染色 电泳终了，将膜放入氨基黑 10B 染色，3min 后取出，漂洗，反复几次，至背景漂净为止。用滤纸吸干薄膜。 4 、定量 1取 6 支试管并编号，分别参与 0.4N 氢氧化钠 4ml。 2剪下各条蛋白带和在膜空白部位剪一条带空白带的宽度以最窄的条带为准， why？ ， 将各条带浸入试管， 不时摇动，洗脱蓝色。 3光光度计比色，波长为 650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取其它 5 管的光密度值。 5、计算总吸光度 光密度总

10、和 TA12 各部分蛋白质的百分数： 蛋白质A/T 100 +白蛋白(A)12血清蛋白的 pI 大多在 7.5 以下，在 pH8.6 的巴比妥缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成 A、1、2、五条区带。 蛋白质名称蛋白质名称 等电点等电点 分子量分子量 清蛋白清蛋白 4.88 69000 5.06 1200000 2300000 5.12 90000150000 6.857.50 156000300000 血清在 pH8.6 的缓冲体系中电泳 1h 左右，染色后可显示 5条带。清蛋白泳动最块，其余依次1、

11、2、球蛋白。 等等 电电 聚聚 焦焦 电电 泳泳 不同物质由于带电性质不同，因此在一定的电场强度下挪动的方向和速度不同,可以进展分别。 蛋白质具有许多可解离的酸性基团COOH和碱性基团NH2及其它基团,在一定溶液的pH条件下可解离成带正电荷或负电荷的基团。 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，成为兼性离子，净电位为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 NH3+ + OH NH3+ + OH NH2 P P P COOH H COO H COO蛋白质的阳离子 蛋白质的兼性离子 蛋白质的阴离子 以聚丙烯酰胺作为支持物，两性电解质（Ampholine）在支持物内形成稳定的

12、 pH 梯度，当蛋白质在电场力的作用下，便会在支持物中运动到相当于自身 pH 梯度中聚合成一狭窄的区带而停留。因为 Ampholine 形成的 pH 梯度是一较平滑的稳定的 pH 梯度， 从理论上讲，只要蛋白质的 pI 相差 0.01 就可分离。 血红蛋白的pI 约在 6.9，细胞色素 C 的 pI 为 10.5，两者的 pI 相差较大，可以得到较好的分离。 操作步骤及留意要点操作步骤及留意要点 凝胶配制凝胶配制 ： a 取取10 0.5cm内径的玻璃管，从一端量出内径的玻璃管，从一端量出7cm作好标志，作好标志，用橡皮片封底用两条橡皮圈扎紧，垂直放置。用橡皮片封底用两条橡皮圈扎紧，垂直放置。

13、 b 按实验指点按实验指点page 17 配制凝胶液按顺序，每加一种试配制凝胶液按顺序，每加一种试剂后都要悄然充分摇匀，剂后都要悄然充分摇匀，TEMED最后才参与，参与摇匀后最后才参与，参与摇匀后要立刻灌胶，用长滴管汲取配好的凝胶液，沿玻璃管注要立刻灌胶，用长滴管汲取配好的凝胶液，沿玻璃管注入至入至7 ml标志平面，渐渐注入，防止产生气泡。标志平面，渐渐注入，防止产生气泡。 c 立刻用立刻用5ml注射器配针头注入约注射器配针头注入约0.5cm高的蒸馏水，垂直高的蒸馏水，垂直放置将长滴管及时清洗放置将长滴管及时清洗 留意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对皮肤有留意：丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，留意防止直接接触。刺激作用，留意防止直接接触。 电电 泳泳 将已聚合的凝胶去除水层，垂直插入电泳槽的橡皮管中，将已聚合的凝胶去除水层，垂直插入电泳槽的橡皮管中，留意不要漏液。上槽注入留意不要漏液。上槽注入5%H3PO4，下槽注入，下槽注入2%NaOH，检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必需，检查凝胶管上下口内有无气泡，如有必需排除。上槽接正极，下槽接负极，排除。上槽接正极，下槽接负极，50V预电泳预电泳30min，然后将电压维持在然后将电压维持在250