项目二淀粉酶的制备及活力测定

1、淀粉酶的制备及活力测定指导老师：一、淀粉酶 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。二、实验原理 淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质从而被机体利用。淀粉酶主要包括-淀粉酶和-淀粉酶两种。-淀粉酶可随机作用于淀粉中的-1，4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽

2、糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的黏度降低，因此又称为液化酶。-淀粉酶可从淀粉的非还原末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是-淀粉酶和-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。-淀粉酶不耐热，在7015min钝化。三、实验器材及试剂1、材料萌发的小麦（或稻谷）种子（芽长约1cm）。2

3、、仪器设备 分光光度计；离心机；恒温水浴（37，70，100）；具塞刻度试管；刻度吸管；100mL容量瓶2个；25mL比色管15支；试管8支；电子天平；研钵。3、试剂（均为分析纯）：u 标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL；u 3，5二硝基水杨酸试剂：精确称取1g3，5二硝基水杨酸1g，溶于20mL1mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水稀释至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用；u 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液： A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C

4、6H8O7.H2O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L； B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 取A液13.7mL与B液26.3mL混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液；u 1淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。四、实验步骤 1. 将萌发好的稻谷种子去壳，注意别把芽去掉，称取1g，置于研钵中。 2. 加入少量的石英砂和2mL的蒸馏水，研磨匀浆。 3. 将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15至20分钟。每隔数分钟搅

5、动一次，使其充分提取。 4. 然后在3000转/分转速下离心10分钟。 5. 将上清液过滤，倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即制得-淀粉酶原液。装入试剂瓶中，贴标签，保存于低温冰箱中，为以后的实验使用。（一）麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至25ml。以1号管作为空白调零点，在520nm波长下比色测定，记录吸光度。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。管号管号1234567麦芽糖标准液00.20.61.01.41.82.0蒸馏水2.01.81.41.00.60.20麦

6、芽糖含量00.20.61.01.41.82.03，5-二硝基水杨酸2.02.02.02.02.02.02.0（二）酶液制备：称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取1520min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3000r/min下离心10min，将上清液倒入100ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。(三）-淀粉酶活力测定：取试管3支于每管中

7、各加入酶液1mL，在700.5恒温水浴中准确加热15min，钝化-淀粉酶。取出后迅速用流水冷却。在对照管中加入4mL0.4mol/L氢氧化钠。在4支试管中各加入1mLpH5.6柠檬酸缓冲液。 将4支试管置于恒温水浴中，400.5保温15min，再向各管分别加入40下预热的1%淀粉液2mL，摇匀，立即放入40恒温水浴准确计时保温5min。取出后向测定管迅速加入4mL0.4mol/L氢氧化钠，终止酶活动，准备测糖。操作项目操作项目-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定I-1I-2I-3淀粉酶原液1.01.01.0钝化-淀粉酶置70水浴15min，冷却3，5-二硝基水杨酸2.000预保温将各试管和淀粉溶液置于40恒温水浴中保温10min1%淀粉溶液1.01.01.0保温在40恒温水浴中保温5min3，5-二硝基水杨酸02.02.0（四）淀粉酶总活力的测定：另取4支试管编号，2支为对照，2支为测定管。然后加入稀释酶液1mL。在对照管中加入4mL0.4mol/L氢氧化钠。4支试管中各加入1mLpH5.6柠檬酸缓冲液。以下步骤重复-淀粉酶活力测定第五步的操作，同样准备测糖。（五）结果计算： 淀粉酶活力=CVT/(WVsT)(mg/g/min)。式中，C为从标准曲线上查得的