人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达

1、 人乙酰肝素酶大亚基蛋白在大肠杆菌中的融合表达 作者：李燕杰，李吉学，凌焱，汤国营，林艳丽，朱厚础 【关键词】 人乙酰肝 Cloning, expression and characterization of human heparanse Cterminal subunit protein in E. coli 【Abstract】AIM: To construct the expression vector for heparanase Cterminal subunit and obtain enough protein for further study. METHODS: Full

2、encoding gene of heparanase protein was isolated from the human platenta cDNA library and its expressing vector pGEX2TK50 ku HPA was constructed by cloning its Cterminal subunit gene into the pGEX2TK vector. After transformed by the expression vector, BL21 was induced to express the target protein.

3、RESULTS: BL21 began to express the target protein fused by GST protein and Cterminal subunit protein after 1 h induction and kept producing it until 3 h after induction when the target protein reached a maximum. No degradation of produced protein was observed in the hetero cells. The target protein

4、was expressed mostly in inclusive bodies. When growing at lower temperature, some fused protein was detected soluble in cell lysis. CONCLUSION: The Cterminal subunit protein of heparanase fused with GST protein has been successfully expressed in BL21 . The protein may be a good antigen in preparing

5、the antibody for heparanase and in further study of its function. 【Keywords】 heparanase; Cterminal subunit; pGEX2TK; gene expression 【摘要】 目的： 乙酰肝素酶在肿瘤转移、血管生成、组织发生等过程中起重要作用，其羧基端大亚基蛋白是该酶的重要组成部分，但由于此蛋白在体内含量少，易降解，很难直接从组织内得到一定数量的蛋白. 本研究利用工程菌表达乙酰肝素酶的大亚基蛋白以期得到相当数量的蛋白，以便进一步用于该酶的抗体制备和功能研究. 方法： 从人胎盘cDNA文库中分离乙

6、酰肝素酶蛋白全长编码基因，通过PCR和酶切等方法将乙酰肝素酶大亚基的基因克隆入原核表达载体pGEX2TK中，测序鉴定序列完全正确后，转化大肠杆菌BL21进行表达. 结果： 工程菌BL21成功表达出乙酰肝素酶大亚基融合蛋白. 诱导1 h后工程菌即开始表达大亚基融合蛋白，在诱导3 h后表达蛋白量达到最高，随着时间的延长，目的蛋白没有被降解. 诱导剂IPTG的浓度对其表达量及其表达形式无显著影响. 此蛋白的表达形式主要为包涵体形式. 低温诱导可见少量可溶蛋白存在. 结论： 在大肠杆菌中成功表达了大亚基的融合蛋白. 此蛋白可以用于进一步乙酰肝素酶的抗体制备、免疫鉴定、功能活性等研究. 【关键词】 乙酰

7、肝素酶；羧基端大亚基；pGEX2TK；基因表达 0引言 乙酰肝素酶是迄今发现的惟一能特异性降解细胞外基质和基底膜中的硫酸肝素糖蛋白多糖的内切糖苷酶1. 在肿瘤转移的过程中，肿瘤细胞过度表达乙酰肝素酶破坏细胞外基质和基底膜，降低细胞间质屏障功能，促进肿瘤细胞侵入基质和血管壁，诱发新生肿瘤血管形成2-4. 深入研究其结构、功能及在肿瘤转移中的分子机制并在此基础上开发其抑制剂将为肿瘤转移的治疗提供新方法. 但由于HPA获取困难5，其分子结构、生物学功能、活性调节等多方面尚待进一步阐明. 得到足够数量和纯度的蛋白是进一步研究此酶的关键. 我们从人胎盘cDNA文库中分离出编码完整HPA蛋白的全序列基因，

8、试用多个原核表达系统在大肠杆菌中表达此蛋白，探讨该蛋白在大肠杆菌中的表达特性，为进一步制备特异性HPA抗体及其免疫定位和功能研究奠定基础. 1材料和方法 材料 pGEMT载体和大肠杆菌BL21由军事医学科学院生物工程研究所二室保存. 大肠杆菌DH5购自华美生物工程公司，表达载体pGEX2TK购自Amersham Pharmacia公司. 人胎盘cDNA文库购自Clontech公司. Ex Taq酶，限制性内切酶BamH, EcoR，为大连宝生物工程公司产品，T4 DNA连接酶为Promega公司产品，溶菌酶为华美公司产品. IPTG为Sigma公司产品，氨苄青霉素为华北制药股份有限公司产品，氯

9、霉素购自华美生物工程公司. AntiHPA Antibody 购自Santa Cruz公司，HRP标记兔抗羊IgG购自北京中山生物技术有限公司. 其余试剂均为国产分析纯. 方法 分离乙酰肝素酶蛋白编码基因和测序鉴定以人胎盘cDNA文库为模板，进行PCR. 上游引物5ATGCTGCTGCGCTCG AAGCCTGCGCT3，下游引物5TCAGATGCAAGCAGCAACTTTGGCAT3. PCR条件为： 95 5 min， 变性进入循环；94 30 s， 56 30 s， 72 30 s， 30个循环后72继续延伸5 min. 8 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物后，直接克隆入pGEMT载体

10、，测定基因序列. 构建载体PGEX2TK50 ku HPA根据测定的乙酰肝素酶核苷酸序列，设计了如下一对引物扩增乙酰肝素酶50 ku大亚基基因片段：5CGGGATCCAAAAAGTTCAAGAACAGCAC3， 其中GGATCC为BamH酶切位点，5CGGAATTCTCAGATGCAAGCAGCAACTTTGG3,其中GAATTC为EcoR酶切位点. PCR条件为： 95 5 min 变性进入循环；94 30 s， 60 30 s, 72 30 s， 30个循环后72继续延伸5 min. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物. 将扩增出来的乙酰肝素酶基因大亚基的基因产物纯化，酶切，与质粒载

11、体连接，克隆入PGEX2TK原核表达载体，构建载体PGEX2TK50 ku HPA，转化DH5. 测序鉴定表达载体的序列和阅读框架. 温度、诱导时间、浓度对表达的影响 温度对表达的影响： 将重组表达质粒pGEX2TK50 ku HPA转化大肠杆菌BL21，挑取重组子单菌落接种于LB液体培养基中，分别于25， 30， 37进行诱导表达，收集菌液，进行SDSPAGE分析. 诱导时间对表达的影响：加入IPTG后继续培养5 h诱导目的蛋白表达,每隔1 min取1mL培养物，离心收集菌体分析. 诱导剂浓度对表达的影响： 加IPTG至终浓度分别为， ， ， ， ， ， ， ， ， mmol/L， 37,

12、200 r/min继续培养3 h，分别取1 mL菌液，离心收集菌体分析. 表达产物的可溶性分析取2 mL细菌培养物，离心收集菌体，用去离子水洗涤1次，重悬于1 mL去离子水中，超声波低温破碎菌体，离心，收集上清，另将所得沉淀用去离子水洗1次，重悬于蒸馏水中，分别取上清和沉淀进行SDSPAGE分析. 2结果 人乙酰肝素酶基因的分离扩增与鉴定PCR扩增产物在8 g/L琼脂糖凝胶电泳胶上呈单一特异性条带，长度约1600 bp. 经序列测定和比较，此基因为人乙酰肝素酶全长编码基因. 乙酰肝素酶50 ku大亚基基因序列的扩增乙酰肝素酶50 ku大亚基基因序列的PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶电泳胶

13、上呈单一特异性条带，与预计的1161 bp完全吻合. 重组质粒pGEX2TK50 ku的构建、转化与克隆菌株的鉴定 将重组质粒pGEX2TK50 ku转化大肠杆菌JM109感受态细胞，获得大量转化子. 从中随机挑选几个重组子单菌落，以PCR方法进行鉴定. 琼脂糖凝胶电泳结果显示，采用以pGEX2TK载体测序引物P1和P2扩增出了大小为 kb的特异性片段，表明所检测的克隆中均含有外源目的片段12下一页 插入. 选取一个重组子，提取质粒用BamH和EcoR酶切鉴定，出现 kb的电泳带，与预期结果相符，表明重组质粒构建完全正确. 重组质粒PGEX2TK50 ku的序列测定结果将阳性重组子送测序公司测

14、序，阅读框架正确，无移码，序列没有突变，可以进行目的蛋白的诱导表达. 表达质粒pGEX2TK50 ku在大肠杆菌中的表达含有重组质粒pGEX2TK50 ku的大肠杆菌BL21分别在25， 30和37经IPTG诱导后，SDSPAGE电泳显示在分子质量约76 ku处均有一蛋白表达带，为乙酰肝素酶小亚基与GST融合蛋白，蛋白表达量基本相同. 观察不同诱导时间目的蛋白的表达情况发现，在25诱导1 h后即出现少量目的蛋白表达带，在诱导3 h后目的蛋白表达量达到最高，细胞的生长达到稳定期，此时可获得最高的蛋白产量. 观察不同浓度IPTG对目的蛋白产量表达的影响发现，在IPTG的浓度为 mmol/L的不同范

15、围内，目的蛋白的表达量没有差异，IPTG浓度对目的蛋白的表达无显著影响. 表达产物的可溶性分析大肠杆菌BL21 在25诱导表达的目的蛋白一小部分是可溶性蛋白，位于破菌后的菌体的上清中，大部分形成包涵体，是不可溶的蛋白，位于破菌后的菌体沉淀中. 在37诱导表达的目的蛋白全部形成包涵体，位于破菌后的菌体沉淀中，未见可溶形式的蛋白. 表达产物的Western blot分析含有空载体pGEX2TK50 ku的菌株诱导后，菌体蛋白做Western blot分析，可见在76 ku处有一条免疫印迹条带，为GST与50 ku大亚基融合蛋白. 3讨论 利用基因重组技术构建工程菌以表达目的蛋白，已得到广泛应用.

16、特别在研究某些新发现蛋白时，利用基因工程菌大量表达目的蛋白获得足够的样本以便深入研究，就成为一种打通瓶颈的技术路线. 然而，每一种新功能基因都有它独特的表达特性，需要尝试不同的表达载体，从中选择最理想的表达方法. 我们首先选择了由T5强启动子启动的pQE70/M15工程菌株，在正确构建了带有HPA基因的重组工程菌后，却没有实现表达. 分析原因可能是因为目的基因转录后，其N端形成二级结构，阻碍了翻译. 为了解决好上述问题，我们在目的蛋白N端加上标签蛋白以消除二级结构，使翻译顺利进行. 本研究选用GST基因融合表达系统中的pGEX2TK，构建GST50 ku HPA融合表达重组体. 该载体编码一个

17、谷胱甘肽巯基转移酶基因5，该基因与目的基因的N端融合，当目的基因与GST阅读框一致地克隆入载体，形成的表达重组体在tac启动子启动下，表达GST和目的蛋白的融合蛋白. GST蛋白的优点不仅在于其可以充当表达标签，更使融合蛋白的纯化过程简化：利用与载体配套的亲和层析柱Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白中的担体GST发生的特异性亲和反应，可以直接从细菌裂解物中将融合蛋白纯化出来7. 另外，在制备抗体的过程中，融合在目的蛋白上的GST蛋白还可以作为免疫佐剂提高特异性抗体的产量8. 经过诱导，乙酰肝素酶大亚基融合蛋白在工程菌中获得了较高表达，此蛋白可以用于进一步抗体制备、免疫鉴

18、定和诊断等研究. 为了探讨其在大肠杆菌中的表达特性，我们进一步对表达条件进行摸索，发现在IPTG诱导1 h宿主菌后即开始表达小亚基融合蛋白，在诱导3 h后表达蛋白量达到最高. 诱导剂IPTG的量对其表达量及其表达形式无显著影响. 而在低温诱导时可见少量目的蛋白以可溶性形式表达在细胞质中，其余大部分表达蛋白则形成不可溶性的包涵体，包涵体的形成有利于蛋白的纯化，但表达蛋白需要进一步的复性才能用于进一步研究. 分析原因，可能是由于在表达过程中目的基因表达过快，新生肽链没有足够的时间正确折叠形成天然的三维结构；拥挤环境下过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等. 进一步采用低温诱导表达

19、、高溶氧环境等手段将有助于目的蛋白以可溶形式表达. 研究者可根据这一表达特性选用不同的表达条件以得到自己需要的蛋白形式进行深入研究. 【参考文献】 1 Kussie PH, Hulmes JD, Ludwig DL, et al. Cloning and functional expression of a human heparanase gene J. Biochem Biophys Res Commun, 1999,261:183-187. 2 Elkin M, Ilan N, IshaiMichaeli R, et al. Heparanase as mediator of angio

20、genesis: Mode of action J. FASEB J, 2001,15:1661-1663. 3 Zcharia E, Metger S, ChajekShaul T, et al. Molecular properties and involvement of heparanase in cancer progression and mammary gland morphogenesis J. J Mammary Gland Biol Neoplasisa, 2001,6:311-322. 4 Vlodavsky I, Friedman Y. Molecular properties and involvement of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis J. J Clin Invest, 2001,108:341-347. 5 Pikas DS