第6章分子荧光与磷光

1、College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU第第 六六 讲讲 分子荧光与磷光法分子荧光与磷光法College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU1. 分子荧光、磷光分析法的基本原理分子荧光、磷光分析法的基本原理2.荧光分析仪器荧光分析仪器3. 分子荧光定量分析分子荧光定量分析4.荧光的影响因素，分子荧光的分析应用荧光的影响因素，分子荧光的分析应用College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU基态激发态College of Chemistry & C

2、hemical Engineering, YZU传递途径辐射跃迁无辐射跃迁荧光延迟荧光磷光振动弛豫内部转移系间窜跃外部转移 分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子中电子受激跃迁到激发态后，处于激发态的分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有分子是不稳定的，去激返回到较低激发态或基态时有两种方式：两种方式：无辐射去激和辐射去激无辐射去激和辐射去激.College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU1. 分子荧光、磷光分析法的基本原理分子荧光、磷光分析法的基本原理 分子吸收光能被激发，回到基态所产生的发光为光致发光激发光1.1.光致发光的

3、机理基态激发态荧光或磷光College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU 通常具有不饱和基团的基态分子光照通常具有不饱和基团的基态分子光照后，一个后，一个价电子跃迁，价电子跃迁，跃迁到激发态跃迁到激发态1.2.分子荧光光谱的产生分子荧光光谱的产生基态单重态基态单重态 第一激发单重态第一激发单重态 单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为单重态分子具有抗磁性，激发态的平均寿命约为10-8sn2S+1LJ 光谱项中光谱项中 2S+1=1College of Chemistry & Chemical Engineering, YZUS0IC吸光吸光

4、吸光吸光S0S1S2College of Chemistry & Chemical Engineering, YZUS0吸光吸光 吸光吸光S0S1S2（1）荧光谱图中包含：激发（ex）和发射（em）光谱（2）分子荧光是带状光谱College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU（3 3）. .激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 a.Stokesa.Stokes位移位移 一般情况下， 荧荧 激激 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 b. .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波

5、长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图 2 , 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如 2 )。 c. . 镜像规则镜像规则 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU镜像规则的解释镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似； 基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。 College of Chemistry & Chemic

6、al Engineering, YZU200250300350400450500荧光激发光谱荧光激发光谱荧光发射光谱荧光发射光谱nm蒽的激发光谱和荧光光谱蒽的激发光谱和荧光光谱College of Chemistry & Chemical Engineering, YZUT1S0IC吸光吸光 吸光吸光S0S1S21.3.分子磷光光谱的产生分子磷光光谱的产生College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU基态单重态S0激发态单重态S1S2激发态单重态T1（1）若分子中电子跃迁过程中伴随着自旋方向的改变，由单重态三重态，净自旋 0。这种跃迁为禁阻跃迁

7、（2）三重态分子具有顺磁性，激发态的平均寿命约为10-410S产生磷光的物质较少磷光强度弱提高检测限College of Chemistry & Chemical Engineering, YZUT1S0VRICS0S1S2ISC（3）三重态能量低于单重态.激发 荧光 磷光College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU2.荧光（磷光）分析仪器荧光（磷光）分析仪器College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU2.1 2.1 荧光分析仪器荧光分析仪器 测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品

8、池、测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。双单色器系统、检测器。 特殊点：特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图：基本流程如图：单色器单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器检测器：光电倍增管。2.荧光（磷光）分析仪器荧光（磷光）分析仪器College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU仪仪器器光光路路图图College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU仪器

9、框图仪器框图该型仪器可进行荧光、磷光和发光分析；College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU2.1.1.光源光源n激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽射强度；适用波长范围宽n荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源n荧光光度计中常用高压汞灯和荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯氙弧灯应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源College of Chemistry & Chemical Enginee

10、ring, YZU 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱。能获得光谱。 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱。 第一单色器作用第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长波长 ex ，用此激发光，用此激发光 ex激发液池内的荧光物质。（激发液池内的荧光物质。（VB2 ex为为471nm） 第二单色器作用第二单

11、色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长用来选择测定用的荧光波长 em。 在选定的在选定的 em 下测定荧光强度，下测定荧光强度，定量分析。定量分析。 （VB2 em为为525nm）2.1.2.单色器471nm525nm如测VB2College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU 盛放测定溶液盛放测定溶液. 通常是石英材料的方形池，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边四面都透光，只能用手拿棱或最上边2.1.3.样品池样品池 把光信号转化成电信号把光信号转化成电信

12、号, 放大放大, 直接转成荧光强度直接转成荧光强度荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管。采用光电倍增管。2.1.4、检测器、检测器College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU2.2.激发光谱和荧光光谱获得激发光谱和荧光光谱获得 I固定固定获得方法：先把第二单色器的波长固定，获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的使测定的I 激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。发波长

13、变化的光谱。550nmCHHOHOHONNNNHCHCHCH OHCH22OOH CH C33College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU异常现象异常现象 I固定固定550nm550nm275nmCollege of Chemistry & Chemical Engineering, YZU固定固定 获得方法：先把第一单色器的获得方法：先把第一单色器的波长固定，使激发的波长固定，使激发的471nm荧光强度荧光强度波长（波长（nm)400500Ifl,maxCollege of Chemistry & Chemical Engineering,

14、 YZU固定固定471nm荧光强度荧光强度波长（波长（nm)400500Ifl,max471nmCollege of Chemistry & Chemical Engineering, YZU激发光谱激发光谱和和荧光光谱荧光光谱荧光强度荧光强度波长（波长（nm)300400500硫酸奎宁的两个光谱硫酸奎宁的两个光谱Iex,maxfl,maxCollege of Chemistry & Chemical Engineering, YZU2.3 2.3 磷光分析仪器磷光分析仪器 荧光计上配上磷光测量附件即可对磷光进行测量。在有荧光发射的同时测量磷光。 测量方法：测量方法：（1 1）通常借助于荧光和

15、磷）通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。镜的装置将荧光隔开。（2 2）采用脉冲光源和可控）采用脉冲光源和可控检测及时间分辨技术。检测及时间分辨技术。 室温测量时，不需要室温测量时，不需要杜瓦瓶。杜瓦瓶。College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU定量关系不同（1）同一种光强度的吸收，（2）另一种光的强度仪器光路不同（1）直线，（2）一定的角度荧光法有更优的检测性能College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU磷光的激发与发射的检测不同时磷光法可避免

16、激发背京的干扰，有更优的检测性能College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU 溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia ) 及荧光量子产率(f）有如下关系 If = f Ia 由Lambert-beer定律及吸收光强度的概念，可推导出，当bc 0.05时，有： If = 2.303 f I0 bc 与荧光类似，溶液的磷光强度(IP)与低浓度下磷光物质浓度之间的关系可表示如下： IP= 2.303ST P I0bc 3. 分子荧光（磷光）定量分析分子荧光（磷光）定量分析College of Chemistry & Chemical En

17、gineering, YZU 定量分析依据定量分析依据 If = Kc Ip = Kc1) 标准曲线法标准曲线法最常用的定量分析方法最常用的定量分析方法n将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配将已知量的标准物质与试样在相同条件下处理，配制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。制一系列标准液，测定它们的相对发光强度。n以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横以相对荧光强度为纵坐标，以标准溶液的浓度为横坐标坐标浓度浓度 c1 c2 c3 c4 c5 cx荧光强度荧光强度 If1 If2 If3 If4 If5 IfxxcxcCollege of Chemistry & Chemical

18、Engineering, YZU2) 比较法比较法较简单较简单n如果试样数量不多，可用比较法进行测量如果试样数量不多，可用比较法进行测量n配一标准溶液浓度为配一标准溶液浓度为cs， cs与未知液浓度与未知液浓度cx相近，相近，并在相同条件下测定它们的荧光强度并在相同条件下测定它们的荧光强度 未知液未知液 If x = K cx 标准液标准液 If s = K cs 比较sxfsfxccII00ffsffxsfsfxsxIIIIcIIcc荧光强度减去空白后若有试剂空白，测得的College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU3) 多组分混合物的荧光分

19、析多组分混合物的荧光分析(1) 如果两组分的荧光峰相互不干扰如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定可直接测定n可分别在各自的可分别在各自的 荧荧波长处测定波长处测定,求出它们的含求出它们的含量量(2) 如果两组分的荧光峰相互干扰如果两组分的荧光峰相互干扰,但激发光谱有但激发光谱有显著区别显著区别,在某一激发光下一个组分产生荧光在某一激发光下一个组分产生荧光峰峰,另一组分不产生荧光另一组分不产生荧光;n可选用不同的激发光进行测定可选用不同的激发光进行测定College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU(3) 如果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干如

20、果两组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰扰n利用荧光强度的加和性（If=If1+If2+If3+），在适宜的荧光波长处测定，用联立方程来求解例：硫胺荧例：硫胺荧 C CT T ex =385nm em=435nm 吡啶硫胺荧吡啶硫胺荧C CP P ex =410nm em=480nm相互干扰荧光光谱重叠College of Chemistry & Chemical Engineering, YZUn在在385nm下激发，下激发，在在435和和480nm下分别测荧光强度下分别测荧光强度 =KcK: 纯物质在选定波长下测纯物质在选定波长下测 ,求求K硫胺荧浓度硫胺荧浓度吡啶硫胺荧浓度吡啶硫胺荧浓度Co

21、llege of Chemistry & Chemical Engineering, YZU4.荧光的影响因素，荧光的影响因素， 分子荧光的分析应用分子荧光的分析应用College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU 大多数荧光物质首先吸收紫外可见光大多数荧光物质首先吸收紫外可见光,产生产生 *，n *跃迁激发，经过非辐射跃迁，再发生跃迁激发，经过非辐射跃迁，再发生 * , * n跃迁产生荧光。跃迁产生荧光。 *与与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大跃迁相比，摩尔吸收系数大102103倍，寿命短。倍，寿命短。 *跃迁常产生较强的荧光，跃迁常产生较强的荧

22、光， n *跃迁产生跃迁产生的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光。的荧光弱，但可产生系间窜跃，产生更强的磷光。4.1. 跃迁类型跃迁类型College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU 具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子电子共轭程度越大，越易产生荧光共轭程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强程度越大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强度越强 0.11 205 278苯苯 0.29 286 310萘萘0.46 365 400蒽蒽 350菲菲线状环结构比非

23、线状线状环结构比非线状结构的荧光波长长结构的荧光波长长4.2. 共轭效应共轭效应有较强的荧光有较强的荧光College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发生荧光。数能发生荧光。 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光法测定测定例：例： 3，4 - 苯并苯并芘芘是强致癌物是强致癌物College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU4.3. 刚性平面结构较稳定的平面结构n具有强荧光的分子多

24、数有刚性平面结构具有强荧光的分子多数有刚性平面结构ocoo-oo-coo-oo-荧光素：氧桥把两荧光素：氧桥把两个环固定在一个平个环固定在一个平面上，具有平面结面上，具有平面结构，强荧光物质构，强荧光物质酚酞：无氧桥把两酚酞：无氧桥把两个环固定，不能很个环固定，不能很好的共平面，为非好的共平面，为非荧光物质荧光物质College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU例 1，2 - 二苯乙烯二苯乙烯反式：平面构型反式：平面构型 强荧光体强荧光体顺式：非平面构型顺式：非平面构型 非荧光体非荧光体C=CHHC=CHHCollege of Chemistry

25、 & Chemical Engineering, YZU4.4. 取代基效应取代基效应n取代基对荧光物质的荧光特征和强度也取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影响。分成三类：有很大影响。分成三类：（1）增强荧光的取代基）增强荧光的取代基 有有 -OH、-OR、 -NH2、-NHR、-NR2等等给电子基团。给电子基团。n由于基团的由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与苯环电子（孤对电子）的电子云与苯环上的上的 轨道平行，共享了共轭轨道平行，共享了共轭 电子，扩大了共电子，扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强。轭体系，使荧光波长长移，荧光强度增强。College of Chemis

26、try & Chemical Engineering, YZU（2）减弱荧光的取代基）减弱荧光的取代基 -COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH 吸电子基团吸电子基团, 使荧光波长短移，使荧光波长短移，荧光强度减弱荧光强度减弱 芳环上被芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强，取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量磷光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。效应。（3）影响不明显的取代基）影响不明显的取代基 -NH3+、-R、- SO3H等等- 取代基的

27、空间位阻对荧光也有影响，荧光减弱取代基的空间位阻对荧光也有影响，荧光减弱College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU4.5. 电子跃迁类型n含含N、O、S杂原子的不饱和有机物，如喹啉和芳杂原子的不饱和有机物，如喹啉和芳酮类物质都含有未键合的孤对酮类物质都含有未键合的孤对n电子，电子跃迁多电子，电子跃迁多为为n * ，系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。，系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。n不含不含N、O、S杂原子的有机荧光体多发生杂原子的有机荧光体多发生 * 类型的跃迁，摩尔吸收系数大，约为类型的跃迁，摩尔吸收系数大，约为104，荧光强。，荧光强。College of Chemistry & Chemical Engineering, YZU4.6. 金属螯合物的荧光金属螯合物的荧光 大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，大多数无机盐类金属离子，不能产生荧光，但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量但某些螯合物都能产生很强的荧光，可用于痕量金属离子的测定。金属离子的测定。 不少有机配体是弱荧光体不少有机配体是弱荧光体 或不发荧光，但与或不发荧光，但与Mn+形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强形成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产生荧光。或产生荧光。 例：例