聚合物囊泡共载柔红霉素和阿糖胞苷的研究

1、苏州大学本科生毕业设计（论文）本 科 毕 业 设 计（论 文）学院(部)材料与化学化工学部题 目聚合物囊泡共载柔红霉素和阿糖胞苷的研究制备工艺探索年 级2014级专业功能材料班 级功能材料学号1409404039姓 名延肖指导老师孟凤华 教授论文提交日期2018年05月目 录中文摘要1Abstract2第一章 前言31.1 引言31.2 聚合物囊泡的结构及其制备方法31.3 聚合物囊泡的载药方法41.4 课题提出5第二章 实验部分62.1 材料与试剂62.2 仪器与表征62.3 空囊泡稳定性的测试72.3.1 交联稳定性72.3.2 FBS稳定性72.4 聚合物囊泡包载柔红霉素以及阿糖胞苷方法

2、的筛选72.4.1 pH梯度法82.4.2 硫酸铵梯度法82.4.3 蔗糖八硫酸脂三乙胺梯度法82.5 聚合物囊泡包载柔红霉素以及阿糖胞苷条件的筛选92.5.1 理论载药量的筛选92.5.2 聚合物囊泡溶液pH对载药的影响9第三章 结果与讨论93.1 聚合物的表征93.2 聚合物囊泡稳定性测试结果103.2.1 交联稳定性113.2.2 FBS稳定性133.3 装载柔红霉素和阿糖胞苷载药方法和条件的筛选133.3.1 载药方法的筛选153.3.2 载药前是否调节pH对载药聚合物囊泡的影响163.3.3 不同理论载药量对载药聚合物囊泡的影响17第四章 结论18参考文献19致谢21聚合物囊泡共载柔

3、红霉素和阿糖胞苷的研究中文摘要近年来，急性白血病发病率持续上升，探究有效可用的方法来治疗它已经刻不容缓。聚合物囊泡是由人工合成或天然改性的双亲分子自组装而成的一种超分子聚集体，类似于细胞膜结构，用它来作为药物载体具有能够靶向药物至靶位并控制释放，稳定性好，渗透性高，可降低药物毒副作用等优点。柔红霉素和阿糖胞苷是目前治疗急性白血病最常用的两种药物。目前临床上一般采用的给药方法是自由药的静脉注射，但这种给药方式存在用药效率低、毒副作用大以及适用对象受限等缺点。本文中，我们把由聚合物PEG-P(TMC-DTC)制备的囊泡作为药物载体，使用了三种不同缓冲溶液的主动载药方法共同包载盐酸柔红霉素（DNR）

4、和盐酸阿糖胞苷（Ara-C）。通过调节载药pH、载药量以及搅拌速率等工艺参数探究了能够高效稳定装载DNR和Ara-C的载药方法及条件。并系统研究了空囊泡及载药囊泡的粒径、载药量、交联稳定性等特性。本次研究对于急性白血病的临床治疗和进一步的研究具有重要参考意义。关键词：聚合物囊泡 pH梯度法 硫酸铵梯度法 蔗糖八硫酸脂三乙胺梯度法 主动载药 作者：延肖 指导教师：孟凤华 教授AbstractIn recent years, the incidence of acute leukemia continued to rise. It has become imperative to explore

5、effective methods to treat it. Polymer vesicles (polymersomes) are self-assembled from synthesized or naturally modified amphiphilic molecules. Similar to cell membrane, polymersomes when used as drug carriers are capable of targeting drugs to diseased sites and of controlling drug release. They hav

6、e good stability, high permeability, reduced toxicity of drugs ect. Daunorubicin and cytarabine are the two most commonly used drugs for the treatment of acute leukemia in clinical practice by intravenous injection of free drugs. But low efficiency, severe side effects and restricted application sub

7、ject are generally associated. In this thesis, we used polymersomes prepared from PEG-P (TMC-DTC) as drug nanocarriers and studied three different active drug loading methods for daunorubicin hydrochloride (DNR) and arabidopsis hydrochloride (Ara-C). The drug loading method and conditions for effici

8、ent and stable loading of DNR and Ara-C were explored by adjusting the process parameters such as drug loading pH, drug loading contents, and stirring rate. The characteristics of empty polymersomes and drug-loaded polymersomes such as particle size, drug loading content and cross-linking stability

9、were systematically studied. This study has important reference significance for the clinical treatment of acute leukemia.Keywords: polymer vesicles，pH gradient method，ammonium sulfate gradient method，sucrose octasulfate triethylamine gradient，Active drug loading Written by：Xiao Yan Supervised by：Pr

10、of. Fenghua Meng第一章 前言1.1引言急性白血病（acute leukemia，AL）是造血干细胞恶性克隆性疾病，通常可以分为急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）和急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）两大类，我国AML发病率约为1.62/10万，而ALL则约为0.69/10万。成人以AML多见，儿童以ALL多见1。急性白血病若不经特殊治疗，平均生存期仅3个月左右，短者甚至在诊断数天后即死亡，对人们的生存发展造成了严重的影响2。目前，化学疗法是治疗急性白血病的主要手段，柔红霉素和阿糖胞苷是治疗急

11、性白血病最主要的药物。2017年8月3日，柔红霉素与阿糖胞苷的固定组合药物Vyxeos被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗两种类型的急性髓系白血病，即新确诊的治疗相关性AML（t-AML）和伴骨髓增生异常相关性AML（AML-MRC）。但是，这些化疗药物存在在体内失活，靶向性差，毒副作用大以及释放效率低等缺陷。与此同时，聚合物囊泡作为药物载体具有改变药物在体内的分布、防止药物降解失活、延长药物作用时间等特性，而且经过表面修饰后可以增强强其在血液中的长循环和靶向性3。所以聚合物囊泡作为载体装载柔红霉素和阿糖胞苷的研究成为了研究人员研究的热点。早期的纳米药物载体为脂质体微球，但它具有稳定

12、性差、药物易渗漏、储存期短、组织靶向性差和易被网状内皮系统（RES）迅速清除等缺点4。冻融技术经过多次修改后，依然只有5%-20%的封装分子能够保留在脂质体中，大多数的药物溶解在外面，最后会通过透析或分子排阻层析被分离5。最终，药物的损失会很高，药物脂质的比例也不是最理想。另外有技术运用了乙醇的注入，用毛细针管将脂质的乙醇溶液迅速的注入过量的药物溶液中，形成一个单层的脂质体，它的直径取决于脂质的浓度、注射速率以及脂质的构成和温度。这种方法的封装效率相对较低，而且脂质体溶液会因为乙醇的存在而受损。由于这些早期纳米药物载体以及装载方法的劣势，聚合物囊泡作为一类新型多功能药物载体，因其具有较高的载药

13、量、包封率，特殊的稳定性及可控性，可包载亲脂性药物、亲水性药物及连接生物活性分子，成为了药物载体中的新宠儿，在全世界范围内的研究人员已经开发出了各种各样的聚合物囊泡，例如刺激响应性囊泡、肿瘤主动靶向囊泡等，为聚合物囊泡的临床使用开辟了道路6。1.2聚合物囊泡的结构及其制备方法聚合物囊泡具有和生物细胞膜十分相似的结构和性能，聚合物囊泡的膜一般可以分为三层，囊泡的两个内外表面分别是两个亲水层，处于两个外表面间的内腔则为它的疏水层7。聚合物囊泡的水溶性内腔有利于包封水溶性治疗分子，如药物、酶、蛋白质、DNA等，同时他厚度比较大的疏水性双分子层则有利于包封脂溶性药物。同时，聚合物囊泡表面的亲水性外壳具

14、有空间稳定作用及高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention，EPR)，可避免被网状内皮系统(reticuloendothelial system，RES)吞噬。聚合物囊泡的制备方法主要分为聚合物自组装法、模版法、非共价键法和胶束法。在先前的报道和研究中，分子自组装法是最常用的方法，根据聚合物在水中不同的亲疏水段比例可以形成不同的自组装体，从先前的研究结果看来，当疏水段所占质量比达到60%到80%时聚合物可以形成囊泡。聚乙二醇（PEG）是最常见也是最常用的亲水端，它几乎没有生物毒性，生物相容性好，不易产生免疫反应，可以降低体内蛋白质的非特异性吸附，

15、使他在体内循环的时间大大增加。同时使得柔红霉素和阿糖胞苷更加具有靶向性8-9。1.3聚合物囊泡的载药方法近年来，市面上有一些关于在脂质体内保留更多疏水性药物的方法的报道。这些方法中大部分都是使药物在预先成型的脂质体内沉淀出来，成为与脂质体内部水腔中的离子和化学物质相容性很低的复合物。在一些情况下，通过主动或远程包装，药物的衍生作用能够使疏水药物的封装更有效。当脂质体外部介质从300mM柠檬酸缓冲液（pH4.0）置换成羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液（pH7.4），内部pH和组成不变时，产生了质子梯度效应。可以观察到生物胺和药物的积累。这就是所谓的柠檬酸盐法11，它被广泛的选择用作蒽环类药物的装载。在这

16、种情况下，具有低溶解度的蒽环类药物可以在脂质体内沉淀，形成了所谓的咖啡豆脂质体的外观。柔红霉素和阿糖胞苷能够以100%的效率按照0.3w/w的药物脂质比（D/L）装载，同时在体内有良好的稳定性。一些长的有饱和脂肪酸链的磷脂类分子，例如二硬脂酰磷脂酰碱（DSPC）和氢化卵磷脂（HSPC），这些都用来作为脂质体。聚乙二醇化的磷脂被用作实现长循环效应，药物在体内的释放在这种情况下取决于蒽环分子的疏水性：疏水性高的柔红霉素释放的速率是最非常高的。这个方法已成功的将阿霉素和正定霉素两种药物成功装载到了囊泡中并且已经大规模的投放市场。由于蒽环类盐的聚集和凝胶化，硫酸铵也能使蒽环霉素沉淀物长时间稳定储存。在

17、这种情况下，囊泡通常准备在一个300mM的pH为5.5（中性）的硫酸铵盐溶液中。通过将额外的囊泡中的硫酸铵交换到pH7.4的缓冲液中产生pH梯度。囊泡水相中铵盐的高浓度造成了中性氨分子的扩散（渗透系数为1.3*10-1cm/s）。每有一个氨分子从囊泡离开都会伴随着一个质子的遗留。因此，就形成了pH梯度。图1.1展示了装载过程的原理，梯度的大小取决于NH4+med/NH4+lip的比率。通过降低了NH3的水平来减缓了脂质体内水相的酸化过程，此外，质子化碱在脂质体内的累积导致了内部pH的升高，这引起了NH3水平的升高，同时也降低了pH，能够使更多的药物进入。硫酸铵的盐析效应可能会加快药物的絮凝和凝

18、胶化，因而大大改善了封装和稳定性6,10-17。图1.1硫酸铵法载药期间发生的过程示意图1.4课题提出柔红霉素和阿糖胞苷两种药物对急性白血病的疗效良好，但是目前临床上使用的自由药的给药形式对人体的毒副作用很大，所以聚合物囊泡共载柔红霉素和阿糖胞苷在急性白血病的治疗中有着巨大的潜力。相较于传统的药物载体，聚合物囊泡增加了药物载体对药物的包载能力，提高了药物以及载体在体内的稳定性和循环时间，可以通过调节链长来改变药物在体内的降解性和释放行为，有效提高细胞的摄取率。但是，这些提高只是相对于之前的载体而言，目前它仍然达不到临床使用的要求。所以本文针对如何提高聚合物囊泡共载柔红霉素和阿糖胞苷的载药量以及

19、载药后的稳定性做出了研究。我们使用共聚物聚乙二醇-聚(三亚甲基碳酸酯-1,2-二硫戊环-三亚甲基碳酸酯)（PEG-P(TMC-DTC)）来制备聚合物囊泡，来延长其在人体内的循环时间。采用了pH梯度法、硫酸铵梯度法以及蔗糖八硫酸脂三乙胺梯度法装载药物，从载药囊泡的粒径、载药量、交联稳定性几个方面探究合适的载药方法高效稳定装载盐酸柔红霉素和盐酸阿糖胞苷。第2章 实验部分2.1材料与试剂聚乙二醇-聚(三亚甲基碳酸酯-1,2-二硫戊环-三亚甲基碳酸酯)(PEG-P(TMC-DTC)由我们实验室自己合成。盐酸阿糖胞苷（Ara-C），盐酸柔红霉素（DNR）（北京中硕），蔗糖八硫酸钠（湖北健楚），透析带（M

20、WCO: 3.5k Da，Spectrum），胎牛血清（FBS, Gibco），CL-4B(上海源叶生物科技有限公司)，732阳离子交换树脂（Dowex），芘（上海源叶生物科技有限公司）下列药物均从国药集团有限公司购买直接使用：N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 一水合柠檬酸（C6H8O10H2O），二水合柠檬酸(C6H8O10H2O) ，硫酸铵(（NH4)2SO4 )，十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O），N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（Hepes） 2.2仪器与表征囊泡粒径和粒径分布通过Zeta sizer Nano-ZS动态光散射仪（英国Malvern公司）。紫外通过UH530

21、0双光束分光光度计（日本HITACHI公司）。核磁通过400 MHz超导核磁共振谱仪（Unity Inova，美国瓦里安）。离心通过超速离心机（中国湘仪公司），超速离心管（MWCO 10k）2.3空囊泡稳定性的测试2.3.1交联稳定性在室温条件下，从化学药品冷藏冰箱里取出聚合物PEG-P(TMC-DTC) (5k-14.5k-1.9k),在室温下解冻半小时。聚合物解冻到室温后，用电子秤称取10mg以内的聚合物，以N,N-二甲基甲酰胺（DMF）作溶剂配制成10mg/ml的聚合物溶液。取100l的聚合物溶液，在400rpm转速搅拌下，沿管壁在液面以下缓慢打入900l的磷酸盐缓冲液（pH7.4，10

22、mM）中（枪头略倾斜于溶液搅拌方向），打入后继续搅拌一段时间直至溶液无浑浊即囊泡分散均匀。放入静置摇床中静置4h即可制备空的聚合物囊泡，用来测试其稳定性。1）通过紫外检测双硫五元环的紫外吸收变化，判断交联程度。双硫五元环在326nm处有特殊的紫外吸收峰，交联的过程会使五元环打开而变成线性结构，导致吸光的的下降。2）用芘做荧光探针，芘在纳米粒中的浓度为2.4*10-6M，激发波长为333nm，发射波长为300-400nm，激发狭缝宽度为5nm，发射狭缝宽度为2.5nm，电压为800v，扫描速率为120nm/min，I1为372nm下的强度，I3 为383nm下的强度，以空PB介质作为背景，测试空

23、囊泡的临界聚集浓度（CAC）。2.3.2 FBS及有机溶剂稀释稳定性1）FBS使用前首先用白滤头过滤。随后，我们取900L透析后的聚合物囊泡溶液+100L FBS放入样品池中混合均匀，在液面上通一会氮气，盖上样品池盖，在室温下静置一段时间，同时做一个不加FBS的空白囊泡对照，在0h、12h、24h的时候测试其DLS并观察两组囊泡的粒径变化。2）取250L透析后的聚合物囊泡溶液+750L DMF，室温静置半小时以上，通过动态光散射仪测其粒径及粒径分布。2.4聚合物囊泡包载柔红霉素以及阿糖胞苷方法的筛选2.4.1 pH梯度法称取10mg以内的聚合物PEG-P(TMC-DTC）（5k-14.5k-1

24、.9k），以DMF为溶剂配制成10mg/ml的聚合物溶液（过夜溶解）。室温400rpm搅拌条件下，取100l聚合物溶液沿瓶壁底部（液面以下）缓慢打入900l 10mM pH4.0的磷酸缓冲液（688mg一水合柠檬酸，507mg二水合柠檬酸三钠，500ml二次水）中制备空囊泡，室温下静置4h，测DLS。随后，室温400rmp搅拌条件下，用饱和磷酸氢二钠水溶液调节pH为7.8-8.0，随后立即加入40l 5mg/ml DNR或Ara-C水溶液，搅拌片刻后放入37 oC 100 rpm 摇床过夜12h。之后将聚合物囊泡放入透析带（MWCO 3.5kDa）中用Hepes缓冲溶液（pH7.4 10mM）

25、避光透析6-8小时（前三小时每小时换一次透析溶液，之后每两小时换一次透析溶液）除去有机溶剂和未包载的自由药物，即得到载药聚合物囊泡。通过动态光散射仪测其粒径和粒径分布，通过双光束分光光度计测其包封率和载药量。2.4.2硫酸铵梯度法取0.1mol/L（13.2g/L）的硫酸铵溶液，用磷酸氢二钠饱和溶液调其pH6.5，按照与2.4.1相同的方法制备空的聚合物囊泡。随后将其通过填料为CL-4B的柱子除去囊泡外部未被包裹的硫酸铵，将接收到的纳米粒用超滤管（MWCO 10k）在超速离心机中（转速3850rpm）超滤56min得到1ml空的聚合物囊泡，之后载药操作与pH梯度法相同。2.4.3蔗糖八硫酸酯三

26、乙胺梯度法（TEA8SOS）首先，采用H型732阳离子交换树脂对蔗糖八硫酸钠进行离子交换，得到蔗糖八硫酸，之后用三乙胺进行滴定，使蔗糖八硫酸酯三乙胺的pH值在6.10-6.30之间，得到0.1mol/L蔗糖八硫酸酯三乙胺。之后按照2.4.2中聚合物囊泡的制备方法和载药方法制备载药聚合物囊泡。以上三种方法同时适用于柔红霉素和阿糖胞苷两种药物。2.5聚合物包载柔红霉素以及阿糖胞苷条件的筛选2.5.1理论载药量的筛选我们根据理论载药量的算法：药的质量/（聚合物的质量+药的质量），设计不同的理论载药量，分别取9.1wt.%,16.7wt.%,23.1wt.%,28.6wt.%（柔红霉素）或16.7wt

27、.%,28.6wt.%（阿糖胞苷），在室温下使用蔗糖八硫酸脂三乙胺梯度法的方法制备载药聚合物囊泡（聚合物浓度10mg/ml，药物浓度5mg/ml），通过动态光散射仪测其粒径和粒径分布，双光束分光光度计测其载药量和包封率来筛选最合适的理论载药量。2.5.2聚合物囊泡溶液pH对载药的影响室温下，取聚合物溶液浓度为10mg/ml，使用蔗糖八硫酸脂三乙胺梯度法制备空的聚合物囊泡，之后分为两组，在400rpm搅拌下，一组调pH到7.8后立即加入药物（防止因为温度原因饱和磷酸氢二钠析出），另一组不调节pH（保持聚合物囊泡溶液pH为6.5）直接加入药物，通过动态光散射仪测其粒径和粒径分布，双光束分光光度计测

28、其载药量和包封率来筛选是否需要载药前调节pH。第3章 结果与讨论3.1聚合物的表征本实验中，我们使用的聚合物是PEG-P(TMC-DTC),它是以聚乙二醇单甲醚（MeO-PEG-OH，Mn= 5 kg/mol）作为大分子引发剂，催化剂是磷酸二苯酯（DPP），由环状单体三亚甲基碳酸脂（TMC）和环状1，2-二硫戊环三亚甲基碳酸酯（DTC）开环聚合得到。聚合物的表征如表3.1，核磁共振图谱如图3.1.表3.1-聚合物表征entryMn（kg/mol）Mw/Mn bDesign1H NMRaGPCb15.0-15.0-2.05-14.5-1.931.81.05a：溶剂CDCl3 b：溶剂DMF聚合条

29、件：Cat.: DPP; -OH/ Cat.=1:10; T:40 oC ; M0 :2mol/L;Time :72h图3.1 聚合物PEG-P(TMC-DTC）的核磁共振表征3.2聚合物囊泡稳定性测试结果3.2.1交联稳定性1.）通过紫外检测双硫五元环的紫外吸收变化，判断交联程度。首先，我们使用pH梯度法制备了空的聚合物囊泡，进行交联稳定性的测试。聚合物上有双硫五元环，在326nm处有紫外吸收峰，而交联会使双硫五元环打开变成线性结构，导致吸光度的减小，我们通过这一现象来测定聚合物的交联稳定性。图3.2聚合物的交联程度如图所示，0h代表刚制备好的空囊泡，12h代表空囊泡在摇床里放置一夜未透析，

30、13h代表透析1h后的纳米粒，14h代表透析2h后的纳米粒，16h代表透析4h后的纳米粒，20h代表透析4h后的纳米粒，20h代表透析8h后的纳米粒，32h代表透析结束后的纳米粒在37 oC摇床静置12h。分析可知，在0h和12h纳米粒有明显的紫外吸收峰，说明此时聚合物囊泡还未发生交联或者交联程度比较低，透析后吸光度出现了明显的降低，这说明透析使聚合物发生了交联，并且在整个过程中，吸光度随着时间的推移越来越低，这说明聚合物的交联程度随时间越来越大。2.）用芘做荧光探针，测试空囊泡的临界聚集浓度（CAC）。用芘做荧光探针，芘在纳米粒中的浓度为1*10-6M（in 5uL丙酮），放摇床半小时挥发丙

31、酮，激发波长为333nm，发射波长为300-400nm，激发狭缝宽度为5nm，发射狭缝宽度为2.5nm，电压为800v，扫描速率为120nm/min，I1为371(或372)nm下的强度，I3为382(或383)nm下的强度，以空PB介质作为背景。图3.3空囊泡临界胶束浓度测试我们对透析后的空囊泡进行临界聚集浓度测试得到图3.3，发现并无临界聚集浓度，这说明纳米粒发生了很好的交联，高倍稀释也不会解离成单分子状态。图3.4中，0h代表的空囊，12h代表空囊泡在摇床里放置一夜未透析，13h代表透析1h后的纳米粒，14h代表透析2h后的纳米粒，16h代表透析4h后的纳米粒，20h代表透析4h后的纳米

32、粒，20h代表透析8h后的纳米粒，32h代表透析结束后的纳米粒在37 oC摇床静置12h。下图代表不同时刻聚合物紫外吸收的变化。图3.4双硫五元环紫外吸收监测从图中我们可以看出，对于这种聚合物的空囊泡，在透析过程中聚合物的交联速度最快，尤其是第一个小时，其他过程交联几乎不进行。可能是因为在透析的第一个小时内，有机溶剂透出的速率较快，导致疏水段双硫五元环的距离拉近，有利于交联。3.2.2胎牛血清（FBS）稳定性测试室温下，取10mg/ml的聚合物溶液（PEG-P（TMC-DTC）200l，在400rpm转速下沿管壁深入到液面以下缓慢打入1800l的缓冲溶液中，搅拌片刻制备空的聚合物囊泡，透析后取

33、900l聚合物囊泡溶液再与100l FBS均匀混合，另取250L透析后的聚合物囊泡溶液+750L DMF，室温静置半小时以上，经粒径分析测试得到空囊泡的粒径为56nm，粒径分布（PDI）为0.11。随后通过FBS稳定性及有机溶剂稀释稳定性测试得到图3.5。图3.5空囊泡在FBS中的粒径以及粒径分布由上图可以看出，在0h时，空的聚合物囊泡的粒径和PDI都处于正常值，在FBS中24h以后，囊泡的粒径无明显变化，这说明空囊泡在FBS中的稳定性很好；在用3倍的DMF有机溶剂稀释后，囊泡的粒径有所增大，但是没有观察到单分子的出现，说明聚合物囊泡发生了很好的交联，在良溶剂的稀释下也不会发生破坏。3.3装载

34、柔红霉素和阿糖胞苷载药方法和条件的筛选我们使用了聚合物PEG-P(TMC-DTC)作为药物载体，柔红霉素和阿糖胞苷作为治疗急性白血病的药物，以此为模型探究pH梯度法（Citric acid）、硫酸铵梯度法(NH4)2SO4)和蔗糖八硫酸脂三乙胺法（TEA8SOS）中最适合的装载方法。同时研究了不同理论载药量、载药pH、搅拌、温度等工艺对载药囊泡粒径分布、载药量以及稳定性的影响，我们以此为基础筛选出最适合的聚合物囊泡包载柔红霉素和阿糖胞苷的工艺条件。3.3.1载药方法的筛选在室温下，理论载药量16.7wt .%，聚合物浓度为10mg/ml，药物浓度为5mg/ml，载药前调节pH，分别使用上述提到

35、的三种不同得的载药方法装载药物（每种方法在不同的时间做了三组平行实验），使用动态光散射仪测聚合物粒径和粒径分布，双光束分光光度计测试其实际载药量和包封率。表3.2三种方法下DNR的表征methodsizePDIDLEDLC（nm）（%）（wt.%）Citric acid700.1244.38.1600.0858.210.4640.0872.712.7(NH4)2SO4610.1217.13.3590.2310.22.0530.126.41.3TEA8SOS590.166.53.2500.093.71.2570.183.71.1表3.3三种方法下Ara-C的表征methodsizePDIDLED

36、LC（nm）（%）（wt.%）Citric acid790.148.41.6600.109.91.9640.0910.02.0(NH4)2SO4530.083.20.6590.214.40.9600.084.10.8TEA8SOS500.098.01.6600.215.71.1610.235.01.0由上述数据分析可知，在其他条件都相同的情况下，对于DNR来说，相较于其它两种方法，使用pH梯度法装载药物所得到的药物囊泡拥有最高的实际载药率和包封率，对于Ara-C来说，同样是pH梯度法装载药物所得到的聚合物囊泡实际载药量和包封率最高。图3.6载药聚合物囊泡（DNR）粒径图以上三张图分别是柔红霉素

37、pH梯度法（A）、硫酸铵梯度法（B）、蔗糖八硫酸酯三乙胺梯度法（C）得到的粒径图（1、2、3分别代表三次平行实验），由图可以看出使用蔗糖八硫酸脂三乙胺法制备聚合物载药囊泡得到的囊泡粒径和分布更好。图3.7载药聚合物囊泡（Ara-C）粒径图以上三张图分别是阿糖胞苷在pH梯度法（A）、硫酸铵梯度法（B）、蔗糖八硫酸脂三乙胺梯度法（C）下聚合物载药囊泡的粒径图（1、2、3分别代表三次平行实验），由图可以看出蔗糖八硫酸脂三乙胺法制备的载药聚合物囊泡更好。此外，文献上关于蔗糖八硫酸脂三乙胺法载药的报道较少，所以接下来我们重点用该方法进行后续研究。3.3.2 载药前是否调节pH对载药聚合物囊泡的影响在室温

38、下，理论载药率为16.7wt.%，聚合物浓度为10mg/ml，药物浓度为5mg/ml（仅使用柔红霉素），使用蔗糖八硫酸脂三乙胺梯度法，通过动态光散射仪测聚合物囊泡粒径和粒径分布，紫外分光光度计测试载药囊泡的实际载药量和包封率，探究pH调节对载药囊泡的影响。表3.4 是否调节pH下载药聚合物囊泡的表征（DNR）methodSize 0PDI DLEDLC（nm）（%）（wt.%）调节pH610.233.71.3590.166.53.2500.093.71.2不调节pH570.1845.28.3500.1042.27.82220.4634.06.4由上述实验结果分析可知，对于柔红霉素来说，在使用蔗

39、糖八硫酸三乙胺梯度法时，载药前调节聚合物囊泡溶液pH为7.8，随后立即加入药物的实际载药量和包封率要明显低于不调节pH（保持聚合物囊泡溶液pH为6.5）时载药囊泡的包封率和实际载药量。图3.8是否调节pH下载药聚合物囊泡粒径图由以上粒径图（A表示调节pH，B表示不调节pH，1、2、3分别代表三次平行实验）可以看出，不调节pH的聚合物载药囊泡更加稳定，图B中曲线3可能是由于缓冲液放置时间过久而产生了纳米粒的破坏。3.3.3 不同理论载药量对载药聚合物囊泡的影响在室温下，聚合物浓度为10mg/ml，药物浓度为5mg/ml，载药前不调节pH,都使用蔗糖八硫酸脂三乙胺法载药，通过紫外分光光度计测包封率

40、，探寻最适合的理论载药率。表3.5不同理论载药量对载药聚合物囊泡的影响（DNR）Entry理论载药量sizePDIDLEDLC（wt.%）（nm）（%）（wt.%）19.12560.2163.66.0216.7500.1042.27.8323.1540.1533.19.9428.8540.1032.711.6表3.6不同理论载药量对载药聚合物囊泡的影响（Ara-C）Entry理论载药量sizePDIDLEDLC（wt.%）（nm）（%）（wt.%）116.7600.215.71.1228.8510.147.80.8图3.9不同理论载药量下载药聚合物囊泡粒径图上图为柔红霉素（A）和阿糖胞苷（B）

41、在不同理论载药量下的粒径及粒径分布，1、2、3、4或1、2表示不同的理论载药量（与表3.6、3.7对应），根据分析可知，对柔红霉素（DNR）而言，当理论载药量越低时，实际载药量更接近理论载药量，包封率也越高，而对于阿糖胞苷而言，理论载药量对于载药聚合物囊泡的影响并不明显。9.1wt.%的柔红霉素可能由于缓冲液放置过久导致了纳米粒被破坏。第4章 结论本论文中，我们使用了聚合物聚乙二醇-b-聚(三亚甲基碳酸酯-1,2-二硫戊环-三亚甲基碳酸酯)(PEG-P(TMC-DTC)（各嵌段分子量5-14.5-1.9kg/mol）来制备聚合物囊泡，通过三种不同的方法pH梯度法、硫酸铵梯度法以及蔗糖八硫酸脂三

42、乙胺梯度法来装载两种不同的药物柔红霉素和阿糖胞苷，我们对实验过程中药物的装载方法、pH的影响和理论载药量等工艺参数做了系统的研究，并得出了以下结论：1. 聚合物囊泡在透析后可以发生很好的交联，且在良溶剂稀释下也不会发生破坏。2. 对于柔红霉素（DNR）而言，使用柠檬酸缓冲液（Citrate）的pH梯度法能得到较高实际载药量和包封率的载药聚合物囊泡。在pH和载药量方面，载药前不调节pH到7.8（保持聚合物囊泡溶液pH为6.5）以及理论载药量为9.1wt.%时得到的囊泡实际载药量和包封率高。3. 对于阿糖胞苷（Ara-C）而言，最适合的方法同样是柠檬酸缓冲液（Citrate）的pH梯度法。在载药量

43、方面，不同的理论载药量对阿糖胞苷实际载药量和包封率的影响不大。接下来的工作，我们可以在室温下使用以上的最适工艺装载柔红霉素和阿糖胞苷，然后再以5:1的比例进行物理共混，或是按照表3.2和表3.3的柠檬酸方法共同装载到同一个囊泡中，从而达到其最大的治疗效果。在实验中，我们发现阿糖胞苷的实际载药量和包封率相较于柔红霉素来说有明显的不足，在我尝试了多种方法和改良后有了微量的提高，但是依然远远达不到临床使用的要求。在其他研究中，有研究人员还研究了淀粉纳米粒包载阿糖胞苷18，这种方法下的阿糖胞苷包封率能达到10%至20%左右。研究人员需要探索更多能提高阿糖胞苷载药量的方法，为急性白血病的临床治疗提供支持

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