生物反硝化作用

1、生物反硝化作用1引言反硝化作用是使固定的n由土壤返回大气的主要生物过程。反硝化作用在n循环过程中的中心作用虽然曾使它成为大量研究的主题，但从田间的定量水平到基本的微生物生物化学来说，该过程仍然是土壤n转化中很不了解的一个方面。农业土壤中因反硝化作用造成的n损失的定量估计有巨大的差异，其范围为施入肥料n的0-70%（rolston等，1976，1979，craswell，1978，kisse1和smith，1978；kowalnko，1978）。hauck（1981）在对采用15n的大田n研究进行评论时估计，肥料n的平均亏损在25-30%之间。这种估计出的肥料n损失可能主要是由于反硝化作用造成的

2、，但也会涉及到其它机制（第二十三章，hauck和tanji）。ryden和lund（1980）研究了一些加利福尼亚州的灌溉土壤，他们发现因反硝化作用损失的n总量范围为95-233千克/（公顷.年）。肥料或土壤有机质产生的n03-对地下水或供水污染的潜在威胁促进了人们在过去10年中对反硝化作用的研究。一氧化二氮（氧化亚氮,n2o）在平流层的化学反应中的作用也引起了对反硝化作用过程的兴趣（johnston，1971，crutzen，1970）。已经假设，随着在作物生产中应用的工业或生物固定的n量的增加，由于反硝化作用而产生的n2o将导致地球臭氧防护层的明显破坏（crutzen和ehhalt，197

3、7；mce1roy等，1977；pratt等，1977；sze和rice，1976）和（或）将通过影响对流层的辐射平衡而造成地球表层的不断升温（wang等，1976）。土壤中的反硝化作用既能产生n20，也能产生n2；因此该过程既可作为n2o的来源，又可成为n2o还原为n2时的贮库。反硝化作用在陆地n2o的收支中的重要意义还没有完全弄清楚，但这一问题可促进人们对反硝化作用的进一步研究，它不仅增加了对反硝化作用，而且也增加了对土壤一般的微生物n代谢的理解。2生物化学和微生物学基础2.1定义和途径在美国土壤学会出版的土壤科学名词小辞典（1979）中，反硝化作用被定义为“通过微生物的活动，将硝酸盐或亚

4、硝酸盐还原为气态分子氮或气态氮氧化物的过程”。但包括硝化作用和n03-还原为nh4+的某些微生物n代谢类型也可能通过no2-的还原作用而导致气态n氧化物（n20,n0，或两者都有）的产生（ritchie和nicholas，1972，1974，bo11ag和tung，1972；yoshida和alexander，1970），为了避免混淆，似乎需要有一个更为明白无误的定义。大多数微生物学家认为，反硝化作用是存在于有限的一些微生物属中的一个呼吸过程。在该过程中n的氧化物可作为呼吸作用电子传递的末端电子受体，这种电子传递将底物提供的一个“还原”电子通过许多电子载体传递到一个氧化性更强的n氧化物上。在电

5、子传递到至少几种n氧化物的过程中，能量就通过电子传递的磷酸化作用而被保存下来。在反硝化细菌把no3-或no2-还原为n2和（或）n2o时，它可以在缺乏分子态氧的条件下生长。只能还原为气体产物（主要是n2和n2o）的阴离子的还原作用和产生的气体的数量都具有一些使反硝作用有别于其它类型的微生物n代谢的特点。在硝化作用的过程中，n2o产生的确切机制是不清楚的，n2o气体可能是羟胺氧化（hooper和terry，1979）或n02-被n02-还原酶（ritchie和nicholas，1972，1974）还原的产物。blackmer等（1980）曾提出土壤中发生硝化作用时所产生的n2o来自n02-的还原

6、作用，而且，已经证明降低o2的有效性可增强培养物和土壤中nh4+氧化菌产生n2o（blackmer等,1980；goreau等，1980）。有人提出，当o2不足时，硝化微生物可转变为嫌气呼吸（或反硝化作用）的形式（payne，1973），但尚未证明n氧化物可以作为化能自养nh4+氧化菌生长的唯一的末端电子受体。在n02-还原为nh4+的过程中，n2o产生的机制甚至比硝化作用过程中的机制更不清楚（bollag和tung，1972；yoshida和alexander，1970）。也有些报道表明，当肠细菌中的n2o-还原为nh4+时可产生n2o（tiedje，1981）。在这些微生物中，至少有一种，

7、即肺炎克雷伯氏菌（klebsiella pneumoniae），已报道表明，n2o的发生与利用n2o作为嫌气呼吸时唯一的末端电子受体有关（hom等，1980）。yoshinari（1980）最近报告过n2o可被一种能将n03-还原为nh4+的发酵微生物还原为n2。把反硝化作用与过去认为有着很大不同的其它代谢过程区分开来的困难是由于n代谢的知识日益增长所造成的。未来的研究结果才有可能更清楚地勾划出这些代谢过程的差异或者需要扩大反硝化作用的概念。这种论述将与这里所定义的反硝化作用有关。在过去的10年中，其它评论已涉及到本论题的内容，在某些方面还更为详细（focht和verstraete，1977，

8、delwiche和bryan，1976；stouthamer，1976；garch，1975；payne，1973）。反硝化作用发生的总的要求是（1）存在具有代谢能力的细菌；（2）合适的电子供体，如有机c化合物、还原态s化合物或分子态氢（h2），（3）嫌气条件或限制o2的有效性，（4）n的氧化物，如no3-，no3-或n2o作为末端电子受件，反硝化作用过程中n氧化物还原的途径一般认为是：（+5）（+3）（+2）（1）（0）n03-no2-non2on2这种假设的还原顺序已提出一段时间了，而且已积累了很多支持每种n氧化物在该途径中的作用的证据。应用同位素混合和交换的研究对两种更有“争议”的中间产

9、物，即no和n2o进行了探索。st.john和hollocher（1977）应用15n标记的n02-对铜绿假单孢菌（pseudomonos aeruginosa）进行了研究，他们未能发现标记的15n与非标记的no贮库具有交换作用，而且n2产物也未表现出同位素混合作用。这些工作者得出这样的结论：no不是反硝化作用过程中的一种游离产物。firestone等（1979a）报道了来自n02-的标记13n确实表现出能与加入的两种假单孢杆菌培养中的非标记的no发生大量迅速的混合。这一工作表明，no或者是一个主要的中间产物，或者是能与这样的一种中间产物迅速达成平衡。至于no是否起着专一中间产物的作用，仍然存

10、在着许多不同的看法（zumft和cardenas，1979；zumft和vega，1979；st.tohn和hollocher，1977；delwick和bryan，1976）。产生这种分歧的原因将在有关n02-和no还原酶的段落中作进一步的讨论。新近的同位素交换和动力学证据对还原途径中所涉及到的游离转次亚硝酸（transhyponitrite）（o-n=n-d）2-产生了争议（hollocher等，1980）。用15n对铜绿假单孢菌（st.tohn和hollocher，1977）以及用15n对一些培养物和土壤（firestone等，1980）的交换研究指出，n2o是在n02-还原为n过程中的

11、一种游离的专一中间产物。这些工作，以及在n2o还原酶抑制剂乙炔的存在下，一般所观察到的n2o的化学数量的积累作用似乎都证明n2o可以为反硝化作用的一种主要中间产物（balderston等，1976；yoshinari和knowles，1976）。但是，brgan（1980）新近所做的工作对这种结论提出了一些怀疑。把15n标记的n02-和14n-n2o加入处于稳定期的施氏假单胞菌（pseudomonas stutzeri）的培养物中以后，bryan测定了15n15n，15n 14n和14n 14n在产生n2时的方式。如果简单的还原顺序no3-no2-non2on2成立的话，那么将只能产生15n

12、15n。和14n 14n-n。但发现了二次类型的分布，其n2的主要形式为15n 14n。bryan（1980）也曾报道过虽然铜绿假单胞菌能在形成n2的最后还原步骤中得到能量，但它不能在加有n2o的基质上生长。这些结果的意义并不都是清楚的，因此，n2o作为反硝化作用过程的中间产物的问题还不能得到圆满解答。2.2 有关的微生物据报道，约有23个属的细菌具有反硝化作用的能力。表8-1中所列出的反硝化细菌属包括了13个已经确证的或有广泛记录的细菌属。已报告在棒状杆菌属（corynebacterium）、黄单胞菌属（xanthomonas ）、不动细菌属（acineobacter）和葡萄菌属（glueo

13、nobacter）中存在着反硝化细菌的菌株，其中大部分还没有肯定的分类归属。jeter和ingraham（1981）编辑了更为完整的目录，并包括了对色杆菌属（chromobacterium）、噬细胞菌属（cytophaga）、奈瑟氏菌属（neisseria）、西蒙斯氏菌属（simonstella）、硫小螺菌属（thiomicrospira）和热丝状菌属（thermothrx）的反硝化细菌种的讨论。与ha11所编撰的能把n03-异化还原为no2-的73个细菌属的目录相比较，反硝化作用则似乎只有相对有限的代谢能力。对payne（1976）以及focht和verstraete（1977）以前所编辑的

14、材料最明显的增补是根瘤菌属（rhizobium）、黄杆菌属（flavobacterium）和农杆菌属（agrobacterium）（zablotowicz等，1978；pichinoty等，1976，1977）。一种表观上具有微需氧反硝化能力的磁性螺菌（magnetic spirillum）的原始报道也是令人感到兴趣的（escatamte-semerena，1980）。在所研究的微生物中，大部分都具有把no3-、no2-或n2o作为唯一的末端电子受体而进行还原的能力。少数菌株，如气味产碱杆菌（alcaligenes odorans），则不能利用no3-（pichinoty等，1976，1978

15、b；vangai和klein，1974）。其它少数菌株（一般是荧光假单孢杆菌）会产生n2o作为最终产物（payne和balderston，1978；greenberg和becker,1977；renner和becker，1970）或者在n2o培养基上生长得很差（st.john和hollocher，1977，bryan,1980）。极少见有关微生物能在no培养基上生长的报告（pichinoty等，1978a；ishaque和aleem，1973）。由于no是固有毒性的化合物，所以能在其上生长不是非同寻常，就是很难证实。大部分的反硝化细菌是化能自养生物。这就是说，它们能利用化学能源（不是光源），它

16、们还能利用有机c化合物作为电子供体（还原剂）和作为细胞的碳源。有一种行光合作用的细菌红假单胞菌（rhodopseudomonas sphaeroides）已证明是反硝化菌，但当进行反硝化作用时，它能以化能自养菌的方式生长（satoh，1977）。一些反硝化细菌也能以无机营养菌的方式生长；脱氮硫杆菌（thiobacillus denitrificans）能利用还原的s化合物，脱氮副球菌（paracoccus denitrificans）和产碱杆菌属的一些种都能利用h2用为电子供体（thauer等1977；buchanan和gibbons，1974)。脱氮硫杆菌在进行反硝化作用时，也能以自养生物的

17、方式（利用co2用为c源）进行生长。几乎所有的反硝化菌都是好气生物，只有当n氧化物存在时才能进行嫌气生长。利用o2作为一种电子受体所进行的呼吸和利用n氧化物作为电子受体所进行的呼吸都是相类似的过程，在该过程中，反硝化作用所利用的许多电子载体也可用于o2的呼吸作用（图8-1）。丙酸杆菌属（propionibacterium）中的细菌似乎是目前仅知的能进行反硝化作用的专性嫌气发酵生物（thauer等，1977；payne，1976）。该属中的种已被证实至少拥有电子传递与nox还原作用相偶合所必需的细胞色素（stouthamer，1976），但有关这些微生物对n氧化物进行还原的实质性证据尚不完备。芽

18、孢杆菌属(bacillus)的一些反硝化菌种是既能进行发酵作用又能进行呼吸作用的兼性微生物。(表：表8-1 能进行反硝化作用的细菌属 )属*一些种的重要特征产碱菌属通常能从土壤中得到分离(alccligenes)土农杆菌属一些种是植物的病原菌(agrobacterium)固氮螺菌属(拟)能进行n2固定作用，通常与禾本科植物结合在一起(azospirillum)芽孢杆菌属已报道是高温反硝化菌(bacillus)黄杆菌属新近分离的反硝化菌种(flavobcaterium)适盐菌属(嗜盐细菌属)需要高浓度的盐才能生长(haiobacterium)生丝霉菌属既能进行无机营养型又能进行异养型的生长(hy

19、phomicrobium)副球菌属能在发酵罐中进行反硝化作用(paracoccus)丙酸杆菌属通常能从土壤中得到分离(propionibacterium)根瘤菌属能与豆科植物进行共生固氮(n2)作用(rhizobium)红假单胞菌属光合细菌(rhcaopseudomonas)硫杆菌属一般以化能自养型方式生长(thiobacillus)注释：*这里涉及的许多属都要在教科书中找到。更详细的资料可参看jeter 和ingraham(1981),focht和verstraete(1977),garcia(1975),buchaman和gibbons(1974)的材料。 少数固n2微生物，其中包括巴西固

20、氮螺菌（azospirilum basilense）（从前认为是螺菌spirilum lipoferum）和大豆根瘤菌（rhizobium japonicum）时，它们也都是反硝化菌（zablotowicz等，1978；eskew等，1977，neyra等，1977），neyra和van berkum（1977）以及scott和scott（1978）报道过固氮螺菌属的种能产生与反硝化作用相偶合的固n2作用。但是，nelson和know1es（1978）用o2和no3-对巴西固气螺菌的两个过程进行控制的研究结果指出，在很大程度上固n2作用和反硝化作用是不会同时发生的。no3-转化为no2-的主动

21、还原作用（active reduction）已经显示出可以抑制这种微生物的固氮酶活性（magalhaes等，1978）。在土壤中，固n2活性只有在加入的no3-被反硝化作用耗尽之后才可以检测出来（yoshinari等，1977）。要确定土壤中哪些反硝化微生物在功能上起着重要作用是十分困难的。gamb1e等（1977）对19种土壤进行了研究，他们发现最经常被分离出来的细菌是假单孢杆菌属和产碱杆菌属的菌种。可以预期这些属的许多种可在实验室最经常采用的分离土壤微生物的加富培养基上良好地生长，在决定哪些细菌在土壤反硝化菌中起着重作用方面，至少存在着两个主要困难：培养基的固有选择性或者几乎无法实现的在培

22、养基中模拟复杂的土壤环境的工作，以及所有反硝化菌都具有的双重代谢能力。这就是说从可能发生反硝化作用的土壤中分离出来的菌株并不一定意味着该微生物在自然环境中是以反硝化菌的方式正常地生长的。smith和tiedje（1980）的研究清楚地证实了这两个问题的重要意义。在实验室培养基上能以反硝化菌方式生长良好的土壤分离体在没有加c的土壤上不会有多大的竞争性，而在no3-肉汁上生长最缓慢的菌株则在饱和土壤上生长得最为迅速。这些工作者也发现，不同分离体生长或存活的能力主要取决于土壤是处于嫌气（水饱和的土壤）还是好气条件下。 gamble等（1977）在其对土壤的研究中发现，荧光假单胞菌（pseudomin

23、as fluorescens）包括有已分离到的大型单种。但对该微生物的研究在深度上还很不够。最普通选作生理研究的反硝化菌是脱氮副球菌、pseudomonas perfectomarinus以及铜绿假单胞菌。在这些种中，只有铜绿假单胞菌能在gamb1e等（1977）所研究的土壤中找到。本章所讨论的有关反硝化作用的生物化学知识有可能是利用土壤环境中不甚重要的微生物进行研究而获得的。种之间的酶学特性和控制方面的类似性都很可能存在，但将这些研究结果推广至大田土壤上则需要有条件地进行。2.3 细胞控制在任何代谢过程中，都可在两个基础水平上进行控制，即酶的合成或实际存在的酶的活性。就反硝化作用而言，一些参

24、数（例如o2和no3-）都可在两个水平上控制其过程。本节要讨论的是反硝化作用的遗传学，控制基因发生或随后酶合成的条件，以及最后还要讨论影响酶活性的参数。将可以非常明显地看出，no3-还原为no2-的还原作用的研究比随后发生的还原步骤的研究要深入得多。这可部分归因于这样的事实，即呼吸时no3-还原为no2-的过程普遍存在于许多细菌中而不只是存在于反硝化菌中（hall，1978）。硝化菌中存在的异化作用硝酸还原酶（dnr）的特性与no3-呼吸菌（respirer）中所发现的那些特性十分相似。因此，从no3-呼吸菌得到的信息可普遍外推用于反硝化作用。2.3.1 遗传学关于控制n氧化物还原酶合成的基因

25、还知道得很少，van hartengsveldt等（1971）、vaa hartengsveldt和stouthamer（1973）已分离出铜绿假单胞菌的dnr突变型的基因，并作了部分鉴定占在分离出来的5种不同的突变型中，发现有4种己失去了用于同化目的的n03- 还原n02- 为的能力。这就意味着铜绿假单胞菌只有一种既用于同化作用，又可用于反硝化作用的n03- 还原酶。但是，近期测定的结果表明，4种突变型的n03- 还原酶都不能同化或异化n03- ，其中3种含有多重突变体。第4种菌株则不具把mo参入到进行同化作用或异化作用的no3还原酶中去的能力（sias等,1980）。burke等（1980

26、）和calder等（1980）报道了从脱氮副球菌中分离出dnr突变型的工作，并证明这些突变型中也有一种可能把mo渗入到酶中。van hartingsveldt等（1971）报道过n02- 还原酶活性受到影响的5种铜绿假单胞菌突变型的分离工作。因此获得了一些基因在细菌基因组上的位置的原始材料。细胞色素的光谱研究表明，这些变种可能无法合成n02- 还原酶的d-型细胞色素。有关对no或n2o还原活性的遗传控制至今尚未有见报道。2.3.2 酶的合成异化作用n03- 还原酶的合成一般在o2存在时受到阻遏，而当o2缺乏时，则发生去阻遏作用。在许多研究过的生物中，当o2的供应受限制时（calder等，198

27、0；zumft和vega，1979；swain等，1978）或假设o2的需要超过供应速率时，n03- 还原酶就易于合成。sias和ingraham（1979）报道道了当o2的供应速率为0.02毫摩尔/（o2升.分钟），并在有n03- 存在时，铜绿假单胞菌对dnr的合成就是完全的去阻遏作用。事实上，已发现这些“半好气”（semiaerobic）条件对脱氮富副球菌（calder等，1980）和铜绿假单胞菌（carlson，1981）产生dnr是很适宜的。在02的有效性受到限制的条件下，好气呼吸作用显然为n03-还原作用合成新的蛋白质提供了所需要的能量。实际上，已经证明从高度好气条件突然改变为严格的

28、嫌气条件后，一些反硝化菌就不能生长。推测这可能是由于重新合成另一套酶的机制缺乏能量所致（payne等,1971）相反，一些微生物，如脱氮硫杆菌在大量合成dnr时似乎需要进行严格的嫌气生活（justin和ke11ey，1978）。即使在n03- 缺乏时，单独的嫌气生活也足以使一些微生物如p.perferctomarinus能够进行dnr的合成（payae等，1971；stouthamer，1976）。但是，在许多反硝化菌中，n03- 的存在为dnr的合成所需要，或能大大地增强dnr的合成（calder等，1980；sias和ingraham，1979；stouthamer，1976）。包括n02

29、- 、叠氮化物和氯酸盐在内的其它一些化合物也能作为dnr合成的诱导物或刺激剂（carlson，1981；calder等，1980；stouthamer，1976）。在有足量的o2存在时，dnr不能正常合成的观察结果与一般所观察到的代谢方式相一致，这种方式是当细胞中存在有可以产生更高能量的替代末端受体时，就会阻止某一电子受体的还原酶的形成（stouthamer，1976）。这就为o2对n03- 还原酶合成的阻遏作用提供了一种合理的解释，但对其阻遏作用的机制则无法提供什么信息。在stouthamer1976年的评论中，他论述了一种氧化还原控制的模式。在该模式中，电子传递链成分的氧化还原状态或末端n

30、03- 还原酶都可作为调节还原酶合成的因子，该模式似乎与burke等（1980）和calder等（1980）最近用脱氮副球菌进行研究的结果相一致。该研究涉及叠氮化物作为dnr诱导物的作用和突变对合成调节的影响。反硝化过程中所涉及的其它还原酶的合成调节作用不像n03- 还原酶的研究那样深入。20世纪70年代初期用p.perfectomarinus所作的研究指出，所有进行反硝化作用的酶活性只要在02缺乏时就能同时被诱导出来（payne，1973，payne等，1971；payne和riley，1969）。但从那时起，其它微生物研究中所积累的大量证据表明，n02- 还原酶的合成与dnr的合成并不是协

31、同调节的，而且可普遍观察到n02- 还原酶的大量合成落后于n03- 还原酶合成数小时（calder等，1980；zumft和vega，1979；nelson和knowles，1978；swain等,1978；williams等，1978）。这些研究的大部分工作都是在把培养物转移到有n03-存在的嫌气条件下进行的。n02- 还原酶合成的滞后现象可能说明积累足量的n02- 以引起合成的诱导作用或放大需要时间。但是，一些研究者报道在“半好气”条件下n02- 还原酶并不像n03- 还原酶那样易于合成（calder等，1980；zumft和vega，1979；swain等，1978）。这表明n02- 还

32、原酶合成的滞后现象可能是由于受到不同的02控制所造成的。这些研究的大部分工作都是利用n03- 作为诱导物而进行的，因此，根据02的作用来描述产生n02- （或n03- 的消耗）的作用是有困难的。justin和kelley（1978）报道在脱氮硫杆菌中，当n02- 存在时，n02- 还原酶可在02浓度比n03- 还原酶合成时为高的条件下进行合成。 在一些微生物中，n02- 还原酶的合成落后于n03- 还原酶合成的观察结果可以解释当改变成反硝化条件时培养基和土壤中通常会有n02- 积累的现象。但是，正如后面还要讨论的那样，对n02- 的积累还有其它的解释。像dnr一样，一些微生物如p.perfec

33、tomarinus和alcaligenes 种或achromob acter种，其n2o还原酶的合成显然是在“半好气”条件下进行的（payne等，1971；matwub aara，1971）。由于能在n03- 生长，所以，n2o还原活性的诱导作用是可以被普遍观察到的现象（payae，1973）。然而，由于还原作用的产物n2o可能是实际上的最初诱导物，所以仍然不知道n03- 和n02- 能否作为n2o还原酶合成的有效诱导物。曾有报道，在n2o上生长的细胞其n2o还原作用的速率比在n03- 或n02- 上生长的细胞要高（matsubara，1971；payne 等，1971；delwiche，19

34、59）。firestone和tiedje（1979）报道了n2o还原活性的形成在土壤和培养物中其它反硝化酶类合成后数小时才发生。这种方式可能是由n2o的积累及其随后的诱导作用或n2o还原酶合成的放大作用所造成的。n2o还原活性基形成的滞后现象可以部分地解释在培养和土壤转变为嫌气条件后通常所观察到的n2o的暂时织累作用。2.3.3 酶的活性当活跃的反硝化细菌被转移到完全好气的条件下生长时，n03- 的还原作用便停止了（john，1977；stouthamer，1976）。o2对n03- 还原作用的抑制似乎并不是由于o2对酶本身的直接影响所造成的，o2要能影响还原作用的话，它必须是作为一种末端电子

35、受体而发生作用。vaa hartingsvel和stouthamer（1974）报道了铜绿假单胞菌的一种突变型不能在好气条件下合成某种电子转递成分，但当把它从嫌气生长条件转移到好气条件时，n03-的还原作用并不受多大的影响，同样亦已提出在某些情况下，n03- 的呼吸作用在改变为好气条件后的短期内能继续进行，直到o2的电子传递链起作用为止（stoulthamer，1976）。也有报道，当细胞在好气条件下培养时，细胞中先期形成的n03- 还原酶只能被缓慢地钝化，但从产气克雷伯氏菌（klebstella aerogenes）中提纯出来的n03- 还原酶则不会因暴露于o2中而遭到钝化（stoutham

36、er，1976）。在用脱氮副球菌的研究过程中，john（1977）发现当o2使所有细胞中的n03- 还原作用立即停止时，02和n03- 的还原作用同时都能在膜囊中发生。脱氮副球菌的完整细胞和膜囊之间这种差异的原因尚不清楚。反硝化作用中其它n氧化中间产物的存在似乎并不影响n03- 还原的速率。n02- 的存在不影响脱氮副球菌中n03- 的还原速率（john，1977）。但亚硝酸盐可能将使n02- 还原过程中能量的产生部分地解偶联（meijer等，1979b）。o2对反硝化作用过程中n02- 还原活性的影响似乎与它对n03- 还原作用的影响非常相似，即n02- 还原作用只有在缺乏o2 时才能发生（

37、john，1977）。如前所述，当硝化细菌在n03-上生长时，通常可观察到有n02- 的积累（payne，1973）。payne和riley（1969）用p.perferctomarinus进行的研究证明，在部分纯化的细胞提取液中n03- 可直接抑制no的还原作用。因此，payne（1973）提出n03- 的这种抑制作用会引起n02- 的积累。近年来，betlach（1979）在可使n03- 还原酶活性失活的钨酸盐条件下，对生长着的荧光假单胞菌和一种黄杆菌属进行的研究证明，n02- 还原作用的速率不会受到n03- 的影响。在n03- 和n02- 都能被还原的细胞中，n02- 的积累速率似乎简要

38、地反映出n03- 和n02- 还原速率的差异。02的存在或把它当作一种电子受体都会影响到n2o的还原作用。betlach（1979）用一些培养物进行的研究指出，与o2有关的n2o的产生量随着o2有效性的增加而提高，而气体产生的总量则有所下降。有关o2对反硝化作用的气态产物影响的类似观察结果也已在土壤中得到（firestone等，1979b；cady和bartholomew，1961，nommik，1956）。这些结果可以根据02对n2o还原作用的抑制影响大于它对先前还原作用的影响来予以解释。但是，betlach（1979）在进行硝化作用过程中还原步骤的动力学模式研究后提出，如果0能同等地抑制反

39、硝化作用中的所有步骤，那么，随着o2浓度的提高，必将增加与n2有关的n2o的产生量。在嫌气条件下，培养物（delwiche和bryan，1976；payen，1973）中以及土壤（garcia，1975）中通常都能积累n2o。对这种观察结果的一种普遍解释是n03-（或n02-）比n2o是更好的一种电子受体（payne，1973；delwiche，1959）。这种解释与土壤中所观察到的结果相一致，在土壤中，n2o的还原速率随n03- 或n02- 的增加而下降（ firestone 等，1979b；blackmer和bremner，1978）。但是，batlach（1979）用几种不同的反硝化培养

40、物进行研究时发现n03- 或n02-（及其还原作用）的存在对n2o还原作用速率没有影响。n03- 或n02- 对土壤和培养物中n2o还原作用影响的差异可能是由电子供体（c的化合物）的有效性不同所造成。如果反硝化作用的速率受到还原当量的有效性（在某些土壤中可能确实存在）的限制，那么，选择利用n03- 或n02- 的优点就是很明显的了。但是，如果是反硝化作用的受体受到限制，那么n03- 和n02- 都可能以最大的速率遭到还原。sorensen等（1980）报道过硫化物可抑制荧光假单胞菌中n2o的还原作用（和no的还原作用）的速率。一些其它的环境参数也显示了能引起与n2有关的n2o量的增加（表8-2

41、），其它一些因子（ph，c，温度）将在与这些论题有关的后续段落中进行讨论。在某些情况下，如在n03-/ n02-和硫化物的影响下，n20的积累似乎是由n2o还原作用受到抑制而造成的。就其它因子而言，与n2有关的n2o产量的增加机制尚不清楚。betlach（1979）利用反硝化作用的动力学模式，预言能引起反硝化作用总速率下降的任何因子都能导致n2o产量的增加。(表：表8-2 影响反硝化作用过程中产生n2o和n2比例的因子一览表 )因子对n2o/n2的影响no3-的浓度增加no3-就会增加其比率no2-的浓度增加no3-就会增加其比率o2的浓度增加n2就会增加其比率ph降低ph就会增加其比率并增强

42、no2-的影响硫化物增加硫化物就会增加其比率碳已报道增加c的有效性就会降低其比率eh低于0毫伏的氧化还原电位的变化不会影响其比率(sorensen等，1980）酶的状态与前面还原酶有关的n2o还原活性的合成（或缺乏）都会增加或降低比率注释： 2.4 特异还原酶的特性2.4.1 硝酸还原酶在细菌中，n03- 被还原为n02- 有两个明显的生理目的。第一个目的，n03- 最终被还原为nh4+并作为细胞结构体的唯一n源。第二个目的，在嫌气条件下，n03- 可用作呼吸时的末端电子受体为生长提供能量。根据pichinoty（1973）提出的区分法，在反硝化作用过程中，n03- 还原为n02- 可作为第二

43、个目的，而催化这个还原步骤的酶称作异化硝酸原酶（dnr）或硝酸还原酶a。在嫌气条件下产生的n03- 还原酶a，因最初其具有把氯酸盐还原为亚氯酸盐的能力而得到了验证。关于n03- 还原酶a和b的讨论，可参看stouthamer（1976）的材料。在能利用n03- 进行呼吸作用的所有微生物中，不管其还原的最产物终是n02-、n2o、n2或nh4+，都可以认为n03- 还原为n02- 的过程是相似的。纯化dnr的特性因研究的细菌种和采用的纯化方法而有所不同。从埃希氏大肠菌（escherichia coli）、产气克雷伯氏菌以及脱氮副球菌中分离出来的dnr酶已得到了较为全面的研究。这种酶一般由多个亚基

44、元组成，而且在某些情况下，一种细胞色素b与dnr可以得到共纯化（stouthamer，1976）。这些研究过的酶有几种共同的特性，每一种酶都含有mo、fe（可以作为血红素和非血红素的fe），以及不稳定的硫化物基因。正如前面已讨论过的，不能掺入mo的突变型能产生出钝化的酶（见前节）。当钨酸盐或钒酸盐供给生长在钼酸盐中的微生物时，这些金属都能掺入到n03- 还原酶中，因而产生出非功能性的酶（betlach，1979，scott等，1979；southamer，1976）当fe或mo的螯合或结合剂，如硫（代）氰酸盐（螯合mo），或红菲绕啉（结合fe），都会强烈地抑制dnr的活性（stouthamer

45、，1976）。这些研究结果表明，mo和fe是酶产生活性必不可少的组成部分，但没有迹象表明，这些金属是否直接参与由dnr引起的将电子传递到n03- 的过程。电子顺磁共振（epr）的研究方法已用于探讨几种细菌，包括脱氮副球菌、大肠杆菌和产气克雷伯氏菌的氧化型和还原型n03-还原酶中mo的氧化状态。这些epr研究的结果已由stouthamer（1976）作了总结。epr的某些数据已用于解释氧化型的n03-还原酶含有mo（v），而mo（）则存在于还原的酶中（stouthamer，1976）。但是，有人亦提出了epr数据的其它解释（bray等，1976）。fe-s中心的电子是顺磁共振研究指出，氧化型的n

46、03-还原酶含有非血红素fe（），而且这些fe-s中心可直接参与将电子传递到n03-的过程（stouthamer，1976）。几乎在所有的硝化微生物中，至少发现有一种类型的细胞色素b 参与于将电子传递到n03-的过程（stouthamer，1976）。如图8-1所示，已经提出在细胞色素b的水平上将电子传递到n03-的过程已从好气的电子传递链上分支了出来（stouthamer，1980；haddock和jones，1977；payne，1976）。(图：图8-1 假设的反硝化作用电子传递图式)图注 它与boogerd等（1980、haddock和jones 1977）以及john和whatley

47、（1975）提出的脱氮副球菌和图式相类似有迹象表明，在某些微生物如脱氮硫杆菌（sawhney和nicholas，1978）中，一种细胞色素c参与了将电子传递到dnr的过程（thauer等，1977）。可以期望，n03- 还原作用（和反硝化作用）中所涉及到的特异电子载体将随不同的微生物而变化。在大部分反硝化细菌中，异化n03- 还原酶是结合于膜上的（haddock和johns，1977）。已有证据表明，在大肠杆菌（一种n03- 呼吸菌）中，n03- 还原酶的复合体镶嵌在细胞质膜上，而与n03- 的结合和n03- 的还原作用就发生在外膜表面上（jones和garland，1977；boxer和cl

48、egg，1975；garland等，1975）。但是，kristjanson和hollocher（1979）曾报道，在大肠杆菌中，n03- 还原酶的结合位置是在膜的内表面上。sawada和satoh（1980）发现，n03- 还原酶位于光营养反硝化的红假单胞菌（r.sphaeroides）中的外膜位置上。在脱氮副球菌中，已有证据表明， n03- 可从细胞质接近dnr，而且一种n03- 载体能把n03- 传递到细胞内（kristjanssin等，1978；john，1977）。 kristjansson等（1978）提出由于内部离子减少造成了一个浓度梯度，所以通过促进扩散作用，n03-（和n02

49、- ）可以顺浓度梯度而进入细胞。从反硝化细菌或具有n03- 还原活性的全部细胞中提纯出来的n03- 还原酶的动力学参数只有为数极少的测定数值。纯化dnr酶的km测定值范围由铜绿假单胞菌（fewson和nicholes，1961b）的16微摩尔/升到盐脱氮副球菌（paracoccus halodenifrificans）（rosso等，1973）的1300微摩尔/升。betlach（1979）曾报道在一些反硝化细菌中n n03- 还原活性的michaelis常数低于以前所报道的纯化还原酶常数（15微摩尔/升）。全部细胞的km出测值可能反映了n03- 还原作用或n03- 传递至细胞中的动力学状况。

50、2.4.2 亚硝酸还原酶在反硝化作用中涉及的n03- 还原酶似乎有两种一般的类型。一种是含cu蛋白质，已在裂环无色杆菌（achromobacter cyclochstes）、r.sphaeroides f.sp.denitrficans 以及以前曾作为脱氮假单胞菌来叙述的一种alcaligenes中发现（sawada等，1978；iwasaki和matsubara，1972；iwasaki等，1963）。第二种类型为n03- 还原酶，它是一再细胞色素cd，且似乎更为常见，并研究得较为详细。这种酶由两个相同的亚基组成，每一个亚基都含有一个c-型和一个d-型的血红素，其分子量约为120 000。细

51、胞色素cd的特性在脱氮副球菌和铜绿假单胞菌中研究得更为深入；但是，对p.perfectomarinus，脱氮硫杆菌和粪产碱菌（alealigenes faecalis）中的n02- 还原酶也作了很好的鉴定（zumft等，1979；sawhney和nicholas，1978；gudat等，1973；payne，1973）。在这些细菌中至少有几种n02- 还原酶（如图8-1所示）能从呼吸链的细胞色素c水平位置上接受电子（bamforth和quayle，1978；payne，1976；john和whatley，1975）。关于n02- 还原酶在细胞中的确切位置存在着很大的分歧。在cox和payne（

52、1973），以及matsubara和iwasaki（1971）的早期研究中已发现细胞的可溶性部分有n02- 还原活性。这是一个关键之所在，因为还原酶与细胞膜表观结合的证据不足，所以导致一些研究者得出n02- 的还原作用并不与atp的产生相偶合的结论。最近，sssaraste和kkuruen（1978）发现细胞色素cd结合在铜绿假单胞菌的细胞膜上，但还原酶很容易因操作而溶解下来。在p.perfectomarinus中，zumft和vega（1979）发现，n02- 还原酶在膜的结合体和细胞可溶部分中都能发生。saraste和kuronen（1978）报道了细胞色素cd可以结合在铜绿假单胞菌细胞膜

53、的内表面上；但是，wood（1978）用同样的微生物进行的研究却指出存在着一个周质（细胞外质）位置（perilasmic location）（外膜表面）。在其它两种微生物中，亦已报道了有n02- 还原酶的周质位置的存在（sawada和satoh，1980；meijer等,1979a）。一般认为，酶不能占据一个横跨膜的位置（transmembrane location）。n02- 还原酶在细胞内的位置对决定n02- 在还原剂以前是否必须传递进入细胞中以及对理解竞争剂或抑制剂参与n02还原作用的可能途径都是具有意义的。总之，反硝化细菌中所发现的n02 还原作用的动力学是比较复杂的。sawada等（

54、1978）报道了从光合反硝化细菌中分离出来的含cu型n02- 还原酶的km 值为51微摩尔n02-。robinson等（1979）虽然对脱氮副球菌细胞色素cd的动力学作了较为详细的研究，但仍然不能完全解决n02- 还原作用过程的复杂性问题。在其它可能的解释中，他们提出酶可能受到反应产物的抑制作用。saraste和kuronen（1978）用完整的细胞，细胞上清液和纯化的酶（细胞色素cd型）对铜绿假单胞菌中n02- 的km值作了测定。在每种情况下，lineweaver-burk的试验都揭示了n02- 还原作用的动力学具有一个明显的双相特性。（biphasic character），其两个km值范

55、围为6微摩尔/升和50-85微摩尔/升n02-。saraste和kuronen对这种双相动力学作了几种推断性的解释，其中包括二聚酶上的两个n02- 结合点之间相互作用的可能性。betlach（1979）在他所研究的反硝化培养物中显然找到了简单的n02- 还原作用的动力学，并报告了在产碱菌属的一个种中，在黄杆菌属的一个种中和在荧光假单胞菌中km值分别为12.6和5摩微尔/升n02-。已发现纯化n02- 还原酶形成的最为常见的n02- 还原产物是no（legall等，1979；zumft等，1979；payne，1973）。但是，在一些微生物中，no和n2o都是由n02- 还原酶所产生的（zumf

56、t和vega,1979；sawheny和nicholas，1978，matsubara和iwasaki，1972）。虽然许多证据都确实支持n02- 还原酶使n02- 还原为no是单一步骤，单一电子的还原作用，但在将活体外纯化还原酶的研究结果外推到活细胞内时必须十分谨慎。关于活体内n02- 还原酶的产物和no作为反硝化中间产物的作用仍然存在着很大的分歧（zumft和vega，1979；st.john和hollocher，1977；delwiche和bryan，1976）。一些反硝化培养物中已发现no的产生和还原的方式都与其作为反硝化过程的产物的假设作用一致。根据对土壤no流出量的测定，no的散发

57、量估计为1千克n/（公顷.年）（gaballyt roy，1978），但是，仍不清楚在反硝化过程中由生物对n02-的还原作用所造成的土壤中常见的no比例是多少。亚硝酸盐在土壤中是一种较易参与反应的物质，因而它具有一些可能的化学途径。关于n02- 发生“化学反硝化作用”（chemodenitrication）的文献已相当广泛，在这里不予评述。一些新近发表的论文包括了对n02- 反应和no形成的卓越讨论（smith和chalk，1980a，b；keeney等，1979）。2.4.3 一氧化氮还原酶不像n03- 还原酶和n02- 还原酶那样，对no还原起作用的酶尚未得到高度的纯化和进行广泛的研究。已

58、发现一些微生物的无细胞制剂具有no的还原活性（cox和payne，1973；matsubara和iwasaki，1971；miyata，1971；payne等，1971；miyata等，1969；fewson和nicholas，1961b）。在p.perfectomarines和铜绿假单胞菌中，发现no还原酶活性存在于可溶性部分（cox和payne，1973；payne等，1971；fewson和nicholas，1961b），而在产碱菌属的种中则发现其活性与含有膜的颗粒部分有关（matsubara和iwasaki，1971；miyata，1971）。与n02- 还原酶一样，对no还原活性的这种可能存在的可溶性所得到的解释是no的还原作用并不与atp的形成相偶合。用p.perfectommarinus进行的研究理指出，no还原活性与n02-还原酶是有区别的（cox和payne,1973；payne等