生物学基因克隆的载体

1、第一节第一节 质粒载体质粒载体1、一般特性、一般特性 双链闭合环状双链闭合环状 松弛型松弛型质粒质粒/严紧型质粒严紧型质粒 氯霉素、壮观霉素氯霉素、壮观霉素 ColE1复制起点质粒的复制调控复制起点质粒的复制调控 质粒的不相容性质粒的不相容性 利用同一复制系统的不同质粒不能稳定共存的现象利用同一复制系统的不同质粒不能稳定共存的现象带带pMBI（或（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所）复制起点的质粒在复制起始阶段所产生的转录物的方向及其粗略大小产生的转录物的方向及其粗略大小质粒不亲和现象图解质粒不亲和现象图解2、比较、比较pBR322和和pUC18/19pBR322质粒限制性内切酶图谱

2、质粒限制性内切酶图谱pUC18/19质粒的限制性内切酶图谱质粒的限制性内切酶图谱pUC18/19质粒的多克隆位点质粒的多克隆位点 多克隆位点多克隆位点 筛选标记筛选标记 互补互补 拷贝数拷贝数 分子量分子量乳糖操纵子模型乳糖操纵子模型 IPTG 非代谢诱导物非代谢诱导物 Xgal（无色无色） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 半乳糖半乳糖+5-溴溴-4-氯靛蓝（氯靛蓝（深蓝色深蓝色） -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Xgal显色反应检测法显色反应检测法 质粒质粒 编码编码-半乳糖苷酶氨基末端（半乳糖苷酶氨基末端（ 肽段肽段） 宿主细胞宿主细胞 编码缺陷型编码缺陷型-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（失去正失去正常的氨基末端

3、常的氨基末端） 单独都不能产生有活性的单独都不能产生有活性的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 两者结合在一起，才能形成有功能的两者结合在一起，才能形成有功能的-半乳糖半乳糖苷酶（苷酶（互补互补） lacZ内，具有一段多克隆位点序列（内，具有一段多克隆位点序列（MCS） 在正常情况下，插入到在正常情况下，插入到MCS的外源的外源DNA片段，片段，都会阻断都会阻断-肽链的合成，因此肽链的合成，因此含有重组质粒载含有重组质粒载体的克隆是无色的体的克隆是无色的，它可以与，它可以与含有非重组质粒含有非重组质粒载体的克隆形成的蓝色载体的克隆形成的蓝色“背景背景”明显地区别开明显地区别开来来3、比较、比较pGEM和和

4、pUC18/19 含有噬菌体的含有噬菌体的启动子启动子，可合成，可合成RNA 用途：用途： 杂交探针杂交探针 体外翻译体外翻译 体外剪切反应体外剪切反应4、T载体载体 pMD18-T Vector 高效克隆高效克隆PCR产物（产物（TA Cloning）的专用载体，由）的专用载体，由pUC18载体改建而成载体改建而成 在在 pUC18载体的载体的MCS位点处的位点处的Xbal和和Sal识别识别位点之间插入位点之间插入EcoRV识别位点，识别位点， 用用EcoRV进行进行酶切反应后，再酶切反应后，再在两侧的在两侧的3端添加端添加“T”而成。而成。 大部分大部分耐热性耐热性DNA聚合酶反应时聚合酶

5、反应时都有都有在在 PCR产产物的物的3末端添加一个末端添加一个“A”的特性的特性5、E.Coli的表达载体的表达载体 表达载体和克隆载体的主要区别：表达载体和克隆载体的主要区别： 强启动子和终止序列强启动子和终止序列 E.Coli：SD序列序列真核生物基因在原核生物真核生物基因在原核生物E.Coli中表达中表达 转录转录 翻译翻译 翻译后修饰翻译后修饰 诱导表达和分泌表达诱导表达和分泌表达PBV221限制性内切酶图谱（限制性内切酶图谱（30 / 42 ） 信号肽信号肽 一般特征：一般特征： 含含13-26个氨基酸残基，个氨基酸残基， 在或靠近其在或靠近其N端有端有 一至多个带正电荷的一至多个

6、带正电荷的 氨基酸，氨基酸， 在中部为由在中部为由10-15个氨基酸个氨基酸 （大部或全部是疏水性的）（大部或全部是疏水性的） 组成的疏水核组成的疏水核pTA1529质粒含大肠杆菌质粒含大肠杆菌phoA基因的启动子和信号肽序列基因的启动子和信号肽序列第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体1、噬菌体的特性噬菌体的特性 48.5 Kb 线性双链线性双链DNA 在病毒颗粒内线性，两端单链互补被称作在病毒颗粒内线性，两端单链互补被称作 cos末端末端(cos end) 一旦进入细胞，两个一旦进入细胞，两个cos末端就会迅速相互结末端就会迅速相互结合，形成有缺口的环状基因组，细胞的合，形成有缺口的环状基因组

7、，细胞的DNA连连接酶可以修补该缺口接酶可以修补该缺口 溶源溶源 寄主细胞仍然存活着并持续地进行细胞分裂，寄主细胞仍然存活着并持续地进行细胞分裂，不产生子代噬菌体颗粒不产生子代噬菌体颗粒 溶菌溶菌 寄主细胞因裂解而致死，释放出许多噬菌体颗寄主细胞因裂解而致死，释放出许多噬菌体颗粒粒DNA限制图谱限制图谱2、Charon系列载体系列载体 构建基因组文库构建基因组文库Charon28的限制性酶切位点（的限制性酶切位点（5-24Kb）3、EMBL系列载体系列载体 构建基因组文库构建基因组文库Mbo、BamBamHH、BglBgl、BclBcl、XhoXho、SalSal、EcoEcoRREMBL3和

8、和EMBL4的限制性酶切位点（的限制性酶切位点（23Kb）4、gt系列载体系列载体 构建构建cDNA文库（文库（6-8.2Kb)） 表达表达gt11载体的限制性酶切位点载体的限制性酶切位点利用特异性抗体作为探针筛选利用特异性抗体作为探针筛选gt11表达文库表达文库 插入位点位于插入位点位于LacZ基因的基因的C末端，可作为末端，可作为-半半乳糖苷酶乳糖苷酶融合蛋白表达融合蛋白表达； 可用可用抗体探针筛选抗体探针筛选 蓝白斑筛选蓝白斑筛选 温度敏感诱导表达温度敏感诱导表达 裂解基因中的裂解基因中的琥珀突变琥珀突变 UAG 琥珀型琥珀型 amber UAA 赭石型赭石型 ochre UGA 乳白型

9、乳白型 opal 无义突变无义突变（nonsense） 使蛋白质长度提前终止，引起多肽长度变化使蛋白质长度提前终止，引起多肽长度变化 抑制基因抑制基因 编码生成突变的编码生成突变的tRNA（反密码子突变或其它位置突（反密码子突变或其它位置突变），识别无义密码子，但携带氨基酸。变），识别无义密码子，但携带氨基酸。 某些载体的宿主菌带有一个或者两个很强的琥某些载体的宿主菌带有一个或者两个很强的琥珀突变抑制基因珀突变抑制基因 SupE 在在UAG密码子的位置上加上谷氨酰胺密码子的位置上加上谷氨酰胺 SupF 在在UAG密码子的位置上加上酪氨酸密码子的位置上加上酪氨酸注意这些琥珀突变抑制基因的作用不能

10、互相代替注意这些琥珀突变抑制基因的作用不能互相代替 大大容量容量 减少构建和筛选的重组克隆数减少构建和筛选的重组克隆数 多轮筛选多轮筛选 噬菌体载体容量噬菌体载体容量有限有限 当噬菌体基因组当噬菌体基因组DNA的长度大于野生型的长度大于野生型噬菌体基因噬菌体基因组的组的105%或小于野生型或小于野生型噬菌体基因组的噬菌体基因组的78%时，其存时，其存活力剧降活力剧降第三节第三节 粘质粒载体粘质粒载体 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（35-45Kb） cos site-carring plasmid 带有粘性末端位点（带有粘性末端位点（cos）的质粒）的质粒使用双使用双cos位点载体位点载体c2RB

11、进行的粘质粒克隆进行的粘质粒克隆第四节第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒噬菌体载体及噬菌粒1、 M13噬菌体的特征噬菌体的特征 M13、f1和和fd长度为长度为6.4Kb，单链环状单链环状DNA分分子（正义子（正义DNA基因组）基因组） 仅有的病毒基因组仅有的病毒基因组90%以上都编码蛋白质，以上都编码蛋白质，10个基因中大多数仅以数个核苷酸相隔，仅有两个基因中大多数仅以数个核苷酸相隔，仅有两个较长的个较长的基因间隔区基因间隔区。 复制复制RF 200个拷贝个拷贝/细胞细胞1000个子代噬菌体颗粒个子代噬菌体颗粒/每个细胞每个世代每个细胞每个世代2、 M13噬菌体载体噬菌体载体 丝状噬菌体的所有

12、基因均为必需基因，丝状噬菌体的所有基因均为必需基因， 外源基因放在哪里？外源基因放在哪里？ 基因间隔区基因间隔区 基因基因与基因与基因 基因基因与基因与基因l重组操作重组操作 双链双链DNAl单链单链DNA 可用于可用于DNA序列分析和位点特异性突变的研究序列分析和位点特异性突变的研究M13mp18和和M13mp19载体的限制酶切图载体的限制酶切图 主要不足之处：主要不足之处： 易产生外源易产生外源DNA片段的部分缺失，且外源片段的部分缺失，且外源DNA越大其缺失频率越高，一般情况下其有效越大其缺失频率越高，一般情况下其有效的最大克隆能力仅的最大克隆能力仅1500bp3、噬菌粒（、噬菌粒（ph

13、agemid）：）： 带有丝状噬菌体复制起点的质粒带有丝状噬菌体复制起点的质粒 可容纳较长的外源可容纳较长的外源DNA片段（约片段（约10Kb） 在具有在具有ColE1复制起点及抗生素选择标记的质复制起点及抗生素选择标记的质粒上加上单拷贝的丝状噬菌体主要粒上加上单拷贝的丝状噬菌体主要基因间隔区基因间隔区噬菌粒图解及克隆位点噬菌粒图解及克隆位点 超感染超感染 如何保证子代病毒正链如何保证子代病毒正链DNA主要来自噬菌粒基主要来自噬菌粒基因组？因组？ 噬菌粒中含有来自野生型噬菌粒中含有来自野生型M13 DNA的基因间隔区的基因间隔区 辅助噬菌体（辅助噬菌体（M13K07）基因组中带有来自）基因组中

14、带有来自M13载体载体的基因间隔区的基因间隔区第五节第五节 真核细胞用载体真核细胞用载体 穿梭载体（穿梭载体（shuttle vectors） 在原核细胞中复制扩增；在原核细胞中复制扩增； 在真核细胞中扩增、表达在真核细胞中扩增、表达 基本条件：基本条件：原核基因的复制其始序列和筛选标记原核基因的复制其始序列和筛选标记真核基因的复制其始序列和筛选标记真核基因的复制其始序列和筛选标记启动子序列启动子序列转录终止和转录终止和polyA加入的信号序列加入的信号序列限制性内切酶位点限制性内切酶位点通用的酵母表达载体通用的酵母表达载体重组体借助重组体借助Aox1的的5及及3区序列整合入宿主细胞区序列整合

15、入宿主细胞两种典型的酵母（两种典型的酵母（Pichia）表达载体）表达载体pPIC3和和pPIC3K第六节第六节 人工染色体人工染色体1、YAC（酵母人工染色体，（酵母人工染色体，yeast artificial chromosome） 在酵母细胞中克隆外源在酵母细胞中克隆外源DNA大片段的克隆体系，由酵大片段的克隆体系，由酵母染色体中分离出来的母染色体中分离出来的DNA复制其始序列复制其始序列（ARS，自，自主复制序列）、主复制序列）、着丝点着丝点、端粒端粒以及酵母以及酵母选择性标记选择性标记组组成的能自我复制的线性克隆载体成的能自我复制的线性克隆载体 主要缺点：主要缺点： 易出现嵌合体易出

16、现嵌合体 不稳定不稳定 不容易与酵母自身染色体相分离不容易与酵母自身染色体相分离2、BAC（细菌人工染色体，（细菌人工染色体，bacterial artificial chromosome）3、PAC（P1-derived artificial chromosome）4、MAC（哺乳动物人工染色体，（哺乳动物人工染色体，mammalian artificial chromosome）YAC克隆示意图克隆示意图各种克隆载体的比较各种克隆载体的比较3、比较、比较pGEM和和pUC18/193、EMBL系列载体系列载体 构建基因组文库构建基因组文库Mbo、BamBamHH、BglBgl、BclBcl、XhoXho、SalSal、EcoEcoRREMBL3和和EMBL4的限制性酶切位点（的限制性酶切位点（23Kb）4、gt系列载体系列载体 构建构建cDNA文库（文库（6-8.2Kb)） 表达表达gt11载体的限制性酶切位点载体的限制性酶切位点2、 M13噬菌体载体噬菌体载体 丝状噬菌体的所有基因均为必需基因，丝状噬菌体的所有基因均为必需基因， 外源基因放