溃疡性结肠炎大鼠血清酪酪肽水平及其受体特性的测定

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减溃疡性结肠炎大鼠血清酪酪肽水平及其受体特性的测定（作者：单位：邮编：）作者：潘淑波，刘欣，龚均，董蕾，王景林【摘要】目的 通过测定溃疡性结肠炎（UC）大鼠血清酪酪肽（PYY）水平及其空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的特性来观察UC时血 清PYY水平及其受体的变化。方法 将大鼠随机分成UC组、腹泻型 肠易激综合征（DlBS）组及对照组，用同位素放射免疫法分别检测各 组的PYY水平及反映受体特性的两个参数：平衡解离常数 （Kd）和最 大结合容量值（Bmax）。结果UC及DlBS组血清PYY水平高于对照 组（P0.001），且 UC 组亦高于 D IBS 组（P0.0

2、01）;但 UC 组 Kd 及 Bmax 值与正常组和D IBS组比较均无明显差异（P0.05）。结论UC组PYY 水平高于正常及D_IBS组，推测UC时PYY水平的变化可能与其腹 泻症状和炎症病变的产生有关；UC组的Kd及Bmax与正常组比较 无显著变化，推测UC可能与PYY受体的变化无关。【关键词】 溃疡性结肠炎；胃肠激素；酪酪肽；酪酪肽受体ABSTRACT: Objective To observe the changes of peptide YY (PYY) and its receptors in rats with ulcerative colitis (UC) by detec

3、ting both the serum level of PYY and jejunum epithelial cells in UC rats. Methods Rats were randomly divided into UC group, diarrhea irritable bowel syndrome (D iBS) group and control group. We measured the serum level of PYY by radioim muno assay and made radioligand analysis of two basic parameter

4、s reflecting the characteristics of PYY receptors: dissociation constant (Kd) and maximum binding capacity (Bmax). Results The serum level of PYY was higher in UC and D_IBS groups than in normal group (P0.001), and it was higher in UC group than in D IBS group (P0.001). However, the values of Kd and

5、 Bmax in UC group did not differ sig ni fica ntly from those in D IBS and n ormal groups (P0.05). Conclusion The serum level of PYY in UC group was significantly higher than that in normal group and DIBS group; therefore, we assume that the change of serum PYY level may be related to not only the sy

6、mptom of diarrhea but also inflammation. Kd and Bmax in neither UC group nor DIBS group were significantly different from those in no rmal group, which in dicates that the symptom and inflammation in UC may have nothing to do with the changes of PYY receptors.KEY WORDS: ulcerative colitis (UC); gut

7、hormo ne; peptide;peptide receptor (PYY) 溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)为一种慢性结肠、直肠炎性疾病，又称非特异性溃疡性结肠炎，可发生于各年龄段，并与结肠 癌发病相关。近年来，在我国报告的病例明显增加，国内推算的患病 率为11.6/10万1，已成为常见的肠道疾病和慢性腹泻的主要病因。 但是，其病因和发病机制至今仍不清楚，认为可能与遗传因素、细菌 的感染、机体免疫反应、环境因素及精神因素有关2。酪酪肽(peptide YY, PYY)是近年发现的一种新的胃肠激素，其对于消化道的生理功 能有多种重要调节作用，包括抑制胃肠蠕动3及

8、肠黏膜的分泌4，抑制胆囊收缩5，刺激肠上皮增生6，抑制胰腺外分泌7等。本课 题通过测定UC大鼠的血清PYY水平及其空肠黏膜上皮细胞膜 PYY 受体的平衡解离常数(dissociation constant, Kd)和最大结合容量值 (maximum binding capacity, Bmax)，来观察 UC 大鼠的 PYY 水平及 其受体变化与疾病之间的关系，从而进一步探讨UC的发病机制。1材料与方法1.1实验动物清洁级SD大鼠，雄性，体重200280g，由西安交通大学实 验动物中心提供。1.2主要仪器、药品与试剂紫外分光光度计 UV260 SHIMADZU(日本)；FM200010 丫免疫

9、 计数器(西安凯普机电有限责任公司)；PYY放免试剂盒，PYY，1251 PYY比活度2200Ci/mmol以及50mL/L 2，4，6三硝基苯磺酸 (TNBS)均购于SIGMA公司；考马斯亮蓝蛋白试剂盒(南京建成生物 工程研究所）。1.3实验动物的分组按照随机分配的原则将实验动物分成三组，即 UC组、腹泻型 肠易激综合征（diarrhea irritable bowel syn drome, D J IBS）模型大鼠组 和正常对照组，每组各10只。1.4模型的建立UC大鼠模型的制备8:用50mL/L三硝基苯磺酸（TNBS）与 无水乙醇以体积1 1配成25g（TNBS）/L的混合液；实验前禁食

10、24h , 乙醚吸入麻醉后经肛门插入硅胶管（距肛门8cm）,按相应体重比例灌 入配好的混合液（100mg/kg）,然后再注入一段空气，用手压迫肛门并 将大鼠尾巴抬高30s，造模后大鼠仰卧归笼，同时每天观察大鼠的情 况。根据文献8，UC组大鼠在第7天结肠长度缩短及溃疡分数增加 程度最为明显，遂于造模第7天处死大鼠，剖取距肛门5 9cm结肠 段，沿纵轴剪开，冰生理盐水反复冲洗后，可发现明显的溃疡形成。阳性对照（DjIBS模型大鼠）的制备9_10:实验前12h禁食，实验第 1天给大鼠称重，乙醚吸入麻醉后经肛门插入硅胶管 （距肛门8cm）， 结肠内灌入40mL/L的乙酸1mL。缓慢拔出硅胶管，用手压迫

11、肛门并 将大鼠尾巴抬高30s，然后用生理盐水冲洗结肠。恢复6d。根据文献10乙酸灌肠后第7天结肠组织学恢复正常，但大鼠对结、直肠扩 张刺激的敏感性仍持续增高，遂于实验第7天行束缚应激3h。收集应激期3h内的大鼠粪便，与正常大鼠比较，若粪粒数、粪便湿重和 粪便含水量较对照组增多，表明造模成功。正常对照组：置于安静环境中喂养，自由饮水，摄食，第 7天处死大鼠。1.5血清PYY激素水平的测定处死各组大鼠前分别采其腹主动脉血，离心后获得血清，用同位素放射免疫法检测各组大鼠血清内的PYY激素水平。1.6大鼠空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体的测定按参考文献1112制备大鼠空肠黏膜上皮细胞膜标本；用 考马斯亮蓝

12、法测定大鼠空肠黏膜上皮细胞膜蛋白的浓度；受体放射配基结合分析方法测定大鼠空肠黏膜 PYY受体：模型组和对照组分 别设定反应管和对照管两组，每组设 10个反应浓度；两组均加入已 测定蛋白浓度的细胞膜液；反应管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L 1 町iol/L)依次加入后，再加入 0.05nmol/L125l _PYY ;对 照管中将PYY按照由低到高浓度(1pmol/L1 gol/L)依次加入后， 均再加入0.1町iol/L浓度PYY，0.05nmol/L 125I PYY ；充分混合后， 15 C温孵2h后，加入冰冷HEPES缓冲液终止反应；2000g离心， 弃去上清液，将沉淀进行丫

13、计数。空肠黏膜富含酶类物质，加入杆菌 肽抑制酶类破坏受体。反应管为总结合，对照管为非特异结合，受体 的特异结合二总结合-非特异结合。将得到的PYY受体特异结合数值 换算成特异结合百分率(specific bin di ng, %)做纵坐标，以非标记配体 浓度的对数值(Log mol/L)做横坐标，应用Excel制图软件得到竞争抑 制曲线，应用公式计算Kd及Bmax。1.7统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据以均数士标准差(士s）表示，显著性检验采用多组单因素方差分析，检验水准为0.05。2结果2.1 DlBS组与对照组的排便情况D IBS组在束缚应激期内粪便呈软便或糊状便，粪

14、便颗粒数及湿重大于对照组（P0.05），粪便含水量亦明显多于对照组（P0.05，表1）。表1 D IBS与对照组排便情况的比较（略）2.2各组血清PYY水平及Kd值和Bmax值UC组与 DIBS组血清 PYY水平明显高于正常对照组（P0.05），且UC组明显高于 DIBS组（P0.05）:UC组大鼠空肠黏 膜上皮细胞膜PYY受体的Kd值及Bmax值，与对照组和 DIBS组 比较均无明显差异（P0.05，表2）。表2各组大鼠Kd值及Bmax值 的比较（略）3讨论溃疡性结肠炎是一种以腹泻、黏液脓血便、腹痛为主要临 床表现的肠道疾病，其病变主要局限于黏膜与黏膜下层， 病变轻重不 等，多呈反复发作性的

15、慢性病程1。目前，该病的病因及发病机制仍 未明确，而神经免疫因素是溃疡性结肠炎的研究中比较活跃的部分。 近年来，很多学者也就胃肠激素与溃疡性结肠炎的关系作了多方面的 研究。胃肠激素是由存在于胃肠道黏膜内的数十种内分泌细胞分泌的，主要化学成分为多肽，它可作为循环激素起作用，也可作为旁 分泌物在局部起作用或者分泌入肠腔发挥作用。大量研究表明，UC的发病与胃肠激素水平的异常密不可分。KOCH等13发现UC患者结肠黏膜及黏膜下生长抑素(SS)含量较对照组明显降低，且随着黏膜 炎症程度的加重，SS含量降低越明显；SURRENTI等14测定UC 患者结肠、直肠黏膜中血管活性肠肽(VIP)的含量明显减少，而

16、且VIP 的减少也与黏膜的炎症程度有关；EVANGELISTA等15在三硝基苯 磺酸诱导的溃疡性结肠炎大鼠中发现结肠组织降钙素基因相关肽 (CGRP)的含量也是降低的，同时大量研究表明 UC患者结肠黏膜P 物质(SP)含量明显高于正常人16。综上所述可见，众多胃肠激素都 与溃疡性结肠炎的发病密切相关。PYY作为近年发现的一种新的胃肠激素， 其对胃肠道有多 种复杂的生理功能。这使得它与许多胃肠疾病之间存在着不可分割的 联系。PYY主要由分布于回肠及结肠黏膜的内分泌细胞即L细胞分泌，为36个氨基酸组成的肽类物质17。大量研究表明PYY与多种 胃肠道疾病有关。ADRIAN等18测量了结肠癌组织，结肠

17、息肉及正 常结肠黏膜的PYY浓度，发现PYY浓度在管状息肉中最高，绒毛状 息肉中其次，癌组织中最低，而这个顺序与细胞分化良恶程度是一致 的。这说明PYY可能参与了结肠腺瘤样息肉转变为结肠癌的过程； 有研究19在21例溃疡性结肠炎患者中测量 PYY激素水平，发现其 血清PYY水平明显升高。本实验通过测定 UC模型大鼠血清内PYY的含量，结果表明，UC组血清内PYY水平较正常组明显升高，而 阳性对照D IBS组血清内的PYY水平亦明显高于正常对照组。这说 明PYY水平的异常可能与腹泻症状的产生有关。但是，从本实验中 我们还可看出uc组血清pyy水平还明显高于 Dibs组，从而推测 UC时PYY水平

18、的升高还可能与炎症病变有关。此方面还有待于进 一步的研究。PYY作为胃肠道的一种抑制性激素，不仅抑制胃肠蠕 动，而且可以抑制胃酸和肠液的分泌。PYY水平的升高可能是机体对抗腹泻和炎症的一种保护性作用。 但是，由于许多胃肠激素的释放 都有神经的协同作用，而且胃肠激素本身对胃肠道的调节作用也极其 复杂，因此是否由于UC时其他胃肠激素水平的变化间接导致 PYY 水平的变化，还是由于 UC这个始动因素直接导致PYY水平的变化 还未明了，需要进一步的研究。胃肠激素对靶器官的作用不仅取决于激素水平的高低，而 且还与受体的特性有关。代表受体亲和力的量化指标是平衡解离常数 Kd值。Kd值与受体亲和力呈反向关系

19、。受体的另一重要特征是受体 的分布密度，其量化指标是最大结合容量 Bmax值。Bmax值与受体 的分布密度呈正向关系。早在1986年，MARC等20便通过放免实 验证明PYY与大鼠空肠黏膜上皮细胞膜受体有较高的结合力，同时 对大鼠的多个胃肠脏器包括胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠 以及肝脏等进行PYY与其受体的特异结合实验，结果发现125lPYY 在空肠与其受体的特异结合率最咼。 因此，本实验选择空肠黏膜上皮细胞膜PYY受体作为研究对象，通过测定各组大鼠PYY受体的Kd值和Bmax值，来观察UC时PYY受体的变化。从本实验的研究结 果可以发现UC组其Kd值和Bmax值与正常组比较均无统计学

20、差异， 从而推测UC时其肠道症状和炎性病变的发生与 PYY受体的变化无 关。【参考文献】1 QIN O, RAKESH T, KHEAN LEE G, et al. The emerge nee of in flammatory bowel disease in the Asia n Pacific regi on J. Cur Opi nion in Gastroe nterol, 2005, 21(4):408 413.2 PAPADALIS KA. The etiology and pathogenesis of inflammatory bowel disease J. Gastroe

21、nterol Clinic North Am, 1999, 28(2):283 296.3 WEN J, LEON E, KOST LJ, et al. Duodenal motility in fasti ng dogs:humoral and n eural pathways mediat ing the colo nic brake J. Am J Physiol Gastroi ntest Liver Physiol, 1998, 274(1):G192 G195.4 ETO B, BOISSET M, ANINI Y, et al. Comparison of the an tise

22、cretory effect of en doge nous forms of peptide YY on fed and fasted rat jejunum J. Peptides, 1997, 18(8):12491255.5 HOENTJEN F, HOPMAN WP, JANSEN JB. Effect ofcirculating peptide YY on gallbladder emptying in humans J. Sea nd J Gastroe nterol, 2001,36(10):10861091.6 PETER JM, JENNIFER M. Peptide YY

23、 Y1 receptor activates mitogen activated protein kinase and proliferation in gut epithelial cells via the epidermal growth factor receptor J. BiochemJ, 2000, 350:655 _661.7 KAZANJIAN KK, TOWFIGH S, MCFADDEN DW. Peptide YY exhibits a mitogenic effect on pancreatic cells while improving acute pancreat

24、itis in vitro J. J Surg Res, 2003, 114(1):95 99.8 陈英群，董福轮，马贵同，等.三硝基苯磺酸诱导大鼠 溃疡性结肠炎的实验研究J.同济大学学报，2006, 27(6):31 33.9 LA JH, KIM TW, SUNG TS, et al. Visceral hyperse nsitivity and altered colonic motility after subside nee of inflammation in a rat model of colitis J. World J Gastroenterol, 2003, 9(12):

25、2791 2795.10 邹百仓，董蕾，曹铭波，等.肠易激综合征模型大鼠的 大脑和消化道中5 HT的表达与病理作用J.西安交通大学学报：医 学版，2008, 29(1):43 46.11 MURER H, AMMANN E, BIBER J, et al. The surfacemembrane of the small intestinal epithelial cell: I. Localization of ade nyl cyclase J. Biochim Biophys Acta, 1976, 433(3):509528.12 闫媛，董蕾.大鼠空肠粘膜上皮细胞酪酪肽受体的分布 与特

26、性J.西安交通大学学报：医学版，2009, 30(1):57 59.13 KOCH TR, CARNEY JA, MORRIS VA, et al.Somatostatin in the idiopathic in flammatory bowel disease J. DicCol on Rectum,1988, 31(3):198 203.14 SURRENTI C, RENZI D, GARCEA MR, et al. Colo nic vasoactive intestinal polypeptide in ulcerative colitis J. J Physiol Paris, 1993, 87(5):307 311.15 EVANGELISTA S, TRAMONTANA M. I nv olveme nt of calcitonin generel