PCR、RT-PCR常见问题及分析

1、升博生物升博生物 专业服务专业服务PCRPCR常见问题分析常见问题分析及解决方案及解决方案PCR技术的发明技术的发明p1983 Kary Mullis 发明发明p1985 开始有文章发表开始有文章发表p1993 获诺贝尔奖获诺贝尔奖p广泛用于分子生物学研究广泛用于分子生物学研究领域领域ppcr动画.exePCRPCR技术的基本原理技术的基本原理q 模板模板DNA的变性：的变性：93-95左右，左右，q 模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：Ta=Tm-35 q 引物的延伸：引物的延伸：Taq DNA聚合酶之聚合酶之5-3DNA聚合酶活性聚合酶活性变性变性-退火退火-延伸三个步骤延

2、伸三个步骤 1234522557294时间（min）温度（）PCRPCR的基本原理的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCRPCR标准反应体系标准反应体系pDNA模板p引物p反应缓冲液pMg 2pdNTP p耐热聚合酶pddH2O反应体系对反应体系对PCR扩增的影响扩增的影响pDNADNA模板模板纯度纯度 蛋白、多糖、酚类等抑制PCR反应完整性完整性 模板降解会导致PCR扩增无产物浓度浓度 浓度适当p 引物引物 设计设计 长度适当、避免二级结构和二聚体 合成质量合成质

3、量 浓度浓度 50uL体系引物加量为10-20 pmol反应体系对反应体系对PCR扩增的影响扩增的影响p反应pH、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境pMg 2浓度过高非特异性严重过低无扩增产物浓度适当，避免反复冻融pddH2OpH值适当，避免污染p反应pH、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境pMg 2浓度过高非特异性严重过低无扩增产物浓度适当，避免反复冻融pddH2OpH值适当，避免污染p反应pH、盐离子、稳定剂、增强剂提供缓冲环境pMg 2浓度过高非特异性严重过低无扩增产物浓度适当，避免反复冻融pddH2OpH值适当，避免污染如何选择最合适的如何选择最合适的DNADNA聚合酶聚合酶pPCR用

4、耐热用耐热DNA聚合酶聚合酶（ PCR 实验的不同需求）实验的不同需求）1 Taq酶酶2 pfu酶酶3 Hotstart Taq酶酶Taq plusLong TaqTaq platinum4 混合酶混合酶1 Taq酶酶扩增效率最高扩增效率最高p发现发现1969年，美国黄石国家公园温泉年，美国黄石国家公园温泉p活性活性5-3 DNA聚合酶活性聚合酶活性 强强5-3 DNA外切酶活性外切酶活性 弱弱 荧光探针（定量荧光探针（定量PCR方法）方法）3-5 DNA外切酶活性外切酶活性 无无 错配率每个循环约错配率每个循环约1/6000 3末端加末端加“A” 能能 产物可直接进行产物可直接进行“TA”克

5、隆克隆p生产质检生产质检诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化，分离获得诱导大肠杆菌表达、三次柱纯化，分离获得94kD重组蛋白。重组蛋白。无核酸酶和无核酸酶和 细菌细菌DNA污染污染能有效扩增人基因组单拷贝基因能有效扩增人基因组单拷贝基因室温放置一周，无明显活性改变。室温放置一周，无明显活性改变。2 pfu酶酶保真度高保真度高 p 原理原理具具35核酸外切酶活性，即校正功能。核酸外切酶活性，即校正功能。效率相对较低效率相对较低3末端不加末端不加“A”，加，加A后才可进行后才可进行TA克隆。克隆。p 用途用途表达基因的克隆表达基因的克隆基因的定点突变基因的定点突变细胞内基因点突变分析（细胞内基因点突变分析

6、（SNP）3 HotStart Taq酶酶特异性高特异性高热启动热启动Taq酶酶p原原 理理蜡封蜡封抗体抑制抗体抑制化学修饰化学修饰p提高提高PCR特异性，减少甚至避免非特异性，减少甚至避免非特异性扩增特异性扩增p3加加“A”，可直接做，可直接做“TA”克隆克隆p用用 途途混杂模板混杂模板半定量、定量半定量、定量PCR4 混合酶混合酶高扩增效率高保真度高扩增效率高保真度pTaq plusTaq+pfu用于复杂模板用于复杂模板（GC rich, 二级结构）二级结构）扩增扩增大多数情况下可替代大多数情况下可替代Taq, 特别是产物在特别是产物在6Kb以上时，以上时，可扩可扩10-20kb。pLon

7、g TaqTaq+pfu超长片断扩增，超长片断扩增，15-40kb.pTaq platinumHotStart+pfu高扩增效率高保真度高扩增效率高保真度根据根据PCR实验的不同需求实验的不同需求p基因组扩增、RT-PCR 特特 异异 性性p基因突变、测序、 表达克隆 保保 真真 性性p构建基因图谱、测序等 长片段扩增长片段扩增p复杂模板扩增 (GC含量高、二级结构) 扩增效率扩增效率预配的预配的PCRPCR反应液反应液 DNA聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂 PCR MasterMixPCR MasterMix特特 点点 快速简便 减少加样误差和污染 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的

8、目的模板 特异性强 降低PCR反应的要求，增强特异性 稳定性好 -20一年以上，反复冻融不影响活性。适用范围适用范围 大规模基因检测 目的基因拷贝数极低的样本 GC含量高,有二级结构的模板 复杂基因组样本PCR Master Mix PCR Master Mix 产品特点产品特点升博生物升博生物 专业服务专业服务PCR常见问题分析常见问题分析PCRPCR常见问题常见问题p无扩增产物p非特异性扩增或拖尾p假阳性问题问题1 1：无：无扩增产物扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无M样品样品A 样品样品B 正对照正对照纯度：含有抑制物纯度：含有抑制物浓度：含量低浓度：含量低质量：全长质量：全长结构：

9、二级结构结构：二级结构 原原因因对对策策纯化模板或者使用优质纯化模板或者使用优质试剂盒提取模板试剂盒提取模板DNADNA加大模板的用量加大模板的用量用好的反转录酶用好的反转录酶用温度高的反转录酶用温度高的反转录酶无无扩增产物之模板原因扩增产物之模板原因引物错误引物错误引物设计不好引物设计不好引物降解引物降解引物合成、纯化不好引物合成、纯化不好 原原因因对对策策合成前检查合成前检查评价、重新设计引物评价、重新设计引物换一管新引物换一管新引物免费重新合成免费重新合成无无扩增产物之引物原因扩增产物之引物原因退火温度退火温度延伸时间延伸时间循环次数循环次数 原原因因对对策策递度递度PCRPCR聚合酶的

10、延伸速度聚合酶的延伸速度适当增加循环数适当增加循环数无无扩增产物之扩增产物之PCRPCR条件原因条件原因 现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带问题问题2 2：非特异性扩增：非特异性扩增 M 1 2引物特异性差引物特异性差模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高酶量过多酶量过多MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高退火温度偏低退火温度偏低循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物浓度适当减少酶量适当减少酶量降低镁离子浓度降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温

11、度法减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增非特异性扩增靶序列或扩增产物靶序列或扩增产物 的交叉污染的交叉污染 原原因因开管轻柔，防止形成气溶胶开管轻柔，防止形成气溶胶；防止靶序列吸入加样枪内；防止靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外或溅出离心管外更换试剂、耗材更换试剂、耗材试剂分装，贮存适当。试剂分装，贮存适当。更换实验室和所有试剂耗材更换实验室和所有试剂耗材。问题问题3 3：假阳性：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物对策对策升博生物升博生物 专业服务专业服务提高提高PCR特异性的特异性的策略策略 q 巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNest-PCR）q 递减递减P

12、CRPCR（TouchDownTouchDown PCR PCR）q 热启动热启动PCRPCR（HotStartHotStart PCR PCR）q 使用使用PCRPCR增强剂增强剂策略之一策略之一 巢式巢式PCRPCR（Nest-PCRNest-PCR）P1P2P3P4增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度降低了扩增多个靶位点的可能性提高困难PCR（如5 RACE）特异性 前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。 循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2,直到退火温度低于Tm 5。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递

13、减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。策略之二策略之二 递减递减PCRPCR（TouchDown PCRTouchDown PCR） p热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度p通常选择热启动Taq酶p热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一策略之三策略之三 热启动热启动PCRPCRq甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等q可能的机理：降低熔解温度，有助于引物退火，辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区q增强剂浓度要适当 策略之四策略之四 使用使用PCRPCR增强剂增强剂升博生物升博生物

14、专业服务专业服务RT-PCR简介简介 主要内容主要内容pRT-PCR原理pRT-PCR步骤p常见问题分析两步法两步法RT-PCRmRNA53AAAAAAAAPoly(A)*尾T T T TOligo(dT)Super RnaseH-Reverse TranscriptaseT T T TAAAAAAAAmRNAcDNAT T T TcDNA3553PCR扩增Super RnaseH-Reverse Transcriptase35T T T TcDNAT T T TcDNAPCR扩增53mRNAAAAAAAAAPoly(A)*尾3535一步法一步法RT-PCR两步法与一步法两步法与一步法RT-P

15、CRRT-PCR比较比较两步法一步法引物Oligo dT，随机引物，GSPGSP优点PCR扩增失败时便于分析原因特异性和灵敏度高适用p检测多种目的基因p半定量RT-PCRp大量样品分析p定性p 分析基因的转录水平p 获取目的基因p 合成cDNA探针RT-PCRRT-PCR主要用途主要用途逆转录酶的选择逆转录酶的选择pAMVAMV：禽成髓细胞瘤病毒，逆转录酶和RNA酶H活性。最适42，最新版本可达60 （Bioflux公司）。pMMLVMMLV：Moloney 鼠白血病病毒，逆转录酶，RNA酶H活性较弱。最适37，最新版本42 （赛百盛）pSuper RNaseHSuper RNaseH- -

16、Reverse Transcriptase Reverse TranscriptaseMMLV反转录酶的RNase H-突变体，它能将更大部分的RNA转换成cDNA，最适42。（Tiangen天根生化）RNase HRNase H的作用的作用p水解水解RNA-DNA杂合链中的杂合链中的RNASuper RNaseH- Reverse TranscriptaseMMLV反转录酶的RNase H-突变体逆转录效率高RT-PCR引物的选择引物的选择p随机引物随机引物：适用于长的或具有发卡 结构的RNA,特异性最低。起始浓度范围为20l体系50-250g。p Oligo(dT15-18)：适用于具有P

17、olyA尾巴的RNA。起始浓度范围为20l体系0.2-0.5g。p特异性引物：特异性引物：与目的序列互补，是反义寡核苷酸，适用于目的序列已知的情况。起始浓度范围为20l体系1pmol。提高提高RT-PCRRT-PCR灵敏度灵敏度p分离高质量分离高质量RNA p使用无使用无RNaseH活性的逆转录酶活性的逆转录酶提高提高RT-PCRRT-PCR特异性特异性p提高逆转录酶保温温度提高逆转录酶保温温度 p减少基因组减少基因组DNA污染污染升博生物升博生物 专业服务专业服务RT常见问题常见问题 RNARNA降解或起始量少降解或起始量少RNARNA含抑制成分含抑制成分cDNA 5cDNA 5端不全端不全

18、目的基因在组织中不目的基因在组织中不 表达或表达量太低表达或表达量太低 原因原因对对策策分离高质量的分离高质量的RNARNA使用高温逆转录酶，如使用高温逆转录酶，如RT007RT007（BioFluxBioFlux）使用随机引物或使用随机引物或GSPGSP尝试其它组织尝试其它组织问题问题1 1：RT-PCRRT-PCR没有产物没有产物PCRRT-PCR六种六种TaqTaq和和MasterMixMasterMix：T a qT a q 、 P f uP f u 、HotStart TaqHotStart Taq、Taq Taq plusplus、Long TaqLong Taq、Taq Plat

19、inumTaq PlatinumdNTPdNTP引物 SP6,Tn7,M13SP6,Tn7,M13S u p e r R N a s e HS u p e r R N a s e H- - Reverse TranscriptaseReverse TranscriptaseTA TA 克隆系统：克隆系统：pBS-T pBS-T 载体、连接和克隆试剂盒载体、连接和克隆试剂盒pGM-T pGM-T 载体、连接和克隆试剂盒载体、连接和克隆试剂盒pCF-T pCF-T 、pCF-Blunt pCF-Blunt 载体、快速连接试剂盒载体、快速连接试剂盒感受态细胞感受态细胞DNA MarkerDNA Ma

20、rker：22种不同大小的分子量标准TIANGEN相关产品相关产品升博生物升博生物 专业服务专业服务引物的重要性引物的重要性p引物设计是PCR成功的关键。pPCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。p引物设计需要一定的经验，不能单纯依赖软件。引物设计一般原则：引物设计一般原则：长度长度p引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但长片段扩增时，引物长度30-35 bp。p引物过短易引起错配现象。例：一个12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点，而20bp的引物在人基因组上存在

21、的退火位点只有1/400个.p较长的引物（28-35bp)，还常用来区分同源性较高的模板序列或者用于产生一些突变位点。引物设计一般原则：引物设计一般原则：结构结构p尽量避免引物序列形成发夹，特别是3端。p尽量避免引物间形成二聚体、特别是3端前3个碱基间不能有二聚体。p避开局部富含GC或AT，3端避开连续同样的碱基，如GGG，CCC和AT rich.引物设计一般原则：引物设计一般原则：错配错配p尽量避免引物在模板上有错配位点p3端尤其不要形成非特异性结合。p无法避免错配时，最好不要有产物生成。p引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。引物设计一般原则引物设计一般原则: GC含量含量p引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。p上下游引物的GC含量不能相差太大。p不同的算法推荐45-55%或50-