水溶性凝胶渗透色谱法测定聚乙烯亚胺的分子量及其分布

1、水溶性凝胶渗透色谱法测定聚乙烯亚胺的分子量及其分布刘瑞鹏*，曾宪海，隋国红，赵金铠（青岛迪爱生精细化学有限公司 山东 青岛 266101）摘要：应用水溶性凝胶渗透色谱法测定了聚乙烯亚胺（PEI）的分子量，测试结果与厂家提供结果基本一致。色谱柱为PL aquagel-OH 30, PL aquagel-OH 30和PL aquagel-OH 40三柱串联色谱柱组，流动相为0.20.3 mol/L 的乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH 4.56.0）。系统考察了不同流动相及其pH值，离子强度和进样量对PEI在凝胶柱上吸附等导致的对分析结果的影响。结果发现：增大流动相离子强度有利于减少PEI的吸附，但流动相

2、的pH值对于PEI的吸附具有更重要的影响。该方法具有优良的准确性和重复性。关键词：水溶性凝胶渗透色谱法，聚乙烯亚胺，分子量及其分布，准确性，重复性Determination on Molecular Weight and Distribution of Polyethyleneimine with Aqueous Gel Permeation ChromatographyLIU Ruipeng, ZENG Xianhai, SUI Guohong, ZHAO Jinkai(Qingdao DIC Fine Chemicals Co. LTD Shandong Qingdao 266101)Ab

3、stract：The molecular weight and distribution of polyethyleneimine (PEI) polymers, a series of macromolecular material from Nippon shokubai, was separated by aqueous gel permeation chromatography on PL aquagel-OH 30, PL aquagel-OH 30 and PL aquagel-OH 40 columns and calibrated by universal polyethyle

4、ne glycol standard. The mobile phase was 0.2-0.3 mol/L acetic acid-sodium acetate buffers with pH value of 4.5-6.0. The measured molecular weight was similar to the actual molecular weight given by the manufacturer. The influence of the sorts of mobile phase and its pH value, ionic strength and the

5、injection volume on the adsorption of the samples by the columns were systematically examined. It was found that the pH value and the ion strength of mobile phase affected the accuracy and reproducibility of the results causing mainly by adsorption of PEI greatly. The increases of pH value and ion s

6、trength caused the decrease of adsorption, and moreover, the pH value proved to be a more important factor. The reproducibility of measuring molecular weight and distribution of PEI was controlled within the range of tolerance.Key words：Aqueous Gel Permeation Chromatography, Polyethyleneimine, Molec

7、ular Weight and its Distribution, Accuracy, Reproducibility1 前言聚乙烯亚胺(PEI)是一种广泛使用的高分子材料，可用作造纸助剂、粘合材料及其助剂、涂料及墨水助剂、纺织助剂和分散剂等。此外，聚乙烯亚胺是1995年发现的重要的非病毒核酸载体1，由于具有价格低、操作简单、安全性高等特点而备受关注，是目前应用最广泛的非病毒载体之一。聚乙烯亚胺的组成如分子量大小和分布对其各种应用性能有重要影响，但其分子量及其分布测定有许多困难。常用的黏度法，操作步骤繁琐、误差高且只能测得粘均分子量Mv，而得不到分子量分布的信息。采用TOF-MALDI方法可以

8、得到低分子量PEI的分子量分布信息，但是该方法对高分子量PEI响应很低，很难得到有价值的信息。凝胶渗透色谱法（GPC）是简便快捷的测定多种分子量和分子量分布的有效方法。但是，由于PEI类高分子易和许多商品色谱柱产生吸附，它的凝胶色谱分析并不容易实现。文献报道用四氢呋喃（THF）作流动相对PEI进行GPC分析2。然而，PEI样品在THF中的溶解度极小且在GPC的色谱图中响应值非常低, 很难准确标定它们的分子量。而PEI是水溶性的，利用水溶性GPC更易实现检测。Kumoi等人3利用乙醇胺和乙酸水溶液在TSK-Gel 色谱柱G-2000 PW 和G-3000 PW上检测了PEI高分子的分子量和分子量

9、分布（采用激光光散射器检测）。Guise等人4在硅胶柱上研究了阳离子聚合物聚酰胺、表氯醇树脂、聚乙烯亚胺和聚乙烯吡啶的分析，发现不但pH值、离子强度和色谱柱对分离结果影响显著，盐的种类和高分子的浓度影响也很大。Kissel等人5利用德国PSS（Polymer Standard Service）公司的Suprema Max 3000色谱柱、以1%甲酸为流动相分析PEI类聚合物，但所测得数均分子量Mn值往往接近重均分子量Mw。利用氨乙基甲基丙烯酸酯色谱柱、普鲁兰多糖为标样，他们又在1%甲酸中分离了PEI类高分子和支链聚乙烯乙二醇6，但分离效果有限且测试结果仍远高于实际结果。有人利用水性GPC采用商

10、品PEI为标样、在Ultrahydrogel色谱柱上7分析了PEI-25K供试品和自制的聚乙烯亚胺衍生物，所得结果虽比文献结果更接近理论值，但是测试结果和厂家提供结果偏差仍相当大。综上所述，上述各种方法虽然一定程度上实现了PEI高分子的分析，但是没有对结果准确性及其重复性等方面的评价，且一些方法使用较特殊的手段和设备，导致难以在一般的分析实验室普及应用。本文采用PL aquagel-OH 30, PL aquagel-OH 30和PL aquagel-OH 40三柱串联色谱柱组、利用通用的聚乙二醇标样实现了对PEI的分析分离，考察了影响所得结果的关键因素且发现了影响重复性的主要因素，所得结果有

11、较好的参考利用价值。2 实验部分2.1 药品及试剂聚乙烯亚胺（PEI）为日本触媒产高分子化合物，分子量Mn分别为300、600、1200、1800、10000和 70000标样为Varian公司聚乙二醇(PEG)产品，分子量分别为：106、194、440、628、960、1460、4290、7130、12900、20600、50450、71700、174100、255300纯水由Millipore超纯水离子交换器制得冰乙酸为天津市光复精细化工研究所产色谱纯试剂无水乙酸钠为北京益利精细化学品有限公司产分析纯试剂2.2 仪器设备美国Waters公司 515 HPLC 泵，RI检测器：Waters

12、2414，自动进样器：Waters 717 plus，Waters 柱温箱，Empower 1 色谱工作站，色谱柱尺寸：3007.5mm，填料粒径：8m。 2.3 色谱条件色谱柱：PL aquagel-OH 30, PL aquagel-OH 30和PL aquagel-OH 40三柱串联流动相：0.20.3 mol/L NaAc-HAc缓冲溶液（pH 4.56.0）流速：1.0ml/min，进样体积：200L，柱温：30RI检测器内部温度：30 灵敏度：42.4 样品测试取系列聚乙二醇标样，分别用流动相溶解，取200L进样。记录与之对应的保留时间，用窄分布法作标准曲线。取系列PEI样品，分别

13、用流动相溶解，然后用0.8m聚醚砜针头滤器过滤。取200L进样，在Empower 1色谱工作站记录色谱图，计算分子量。3结果与讨论如前所述，影响PEI类高分子在凝胶色谱上的分析分离效果的因素很多，所以有必要对其进行系统的考察，找到关键因素。我们从最主要的影响因素流动相的选择开始，并进一步研究了pH值、离子强度和进样量等的影响，发现了一些影响分离分析重复性的关键规律。3.1流动相种类的影响水溶性凝胶渗透色谱在测定高分子化合物时存在明显的非体积排除效应8，即离子交换、离子排斥、离子包含、疏水作用等作用，该效应直接影响样品分子量的准确测试，如何消除吸附或降低至最小程度是水溶性GPC测试的关键。根据不

14、同的色谱柱类型可以选择NaNO3溶液或缓冲溶液作为流动相，消除非体积排除效应可以调节流动相的pH值和离子强度。流动相选择的主要原则是该流动相对样品有良好的溶解性，且不与填料发生作用，还要对样品有一定的分离效果。经实验考察，纯水，氨水，磷酸盐溶液作为流动相时都得不到样品流出峰或者信号响应很低，达不到我们的测试要求。经过筛选发现pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液对PEI样品的响应值较大且对不同分子量的样品有一定分离效果，如图1所示：图1 PEI在pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲溶液中的色谱图Figure 1 Chromatogram of PEI in HAc-NaAc buffer solution wi

15、th PH 4.0PEI1800PEI10000PEI70000由图1可以看出：三个样品的保留时间非常接近，峰形不是很对称，有拖尾现象。在该条件下利用聚乙二醇标样校正的分子量与样品的实际分子量相差很大，见表1所示：表1 PEI样品实际分子量和检测分子量的对比Table 1 Comparison of the actual value with measured value of PEI molecular weightSamples Actual Mn Measured Mw ErrorPEI1800 1800 1824 1.33%PEI10000 10000 2310 76.90%PEI70

16、000 70000 2649 96.22%在上述条件下，PEI样品与色谱柱填料之间的非体积排除效应，导致不同分子量的样品会在同一保留时间出峰，分离不好；所以考虑适当调整流动相的pH值，以找到更合适的检测条件。3.2流动相pH值的影响我们分别配制了五种不同pH值的乙酸-乙酸钠缓冲溶液作流动相，对四个PEI样品进行了检测、比较。为了便于比较分离效果，采用峰值保留时间Mp来进行对比。结果发现，pH4.56.0的缓冲溶液对PEI样品的分离较好，见表2所示：表2 PEI样品在不同pH值的流动相中检测到的Mp（min.）Table 2 Mp (min.) of PEI samples measured i

17、n mobile phases with different pH valueSamples pH4 pH4.5 pH4.85 pH6.0 pH8PEI1200 - 26.537 26.895 - 28.855PEI1800 26.489 26.159 26.566 26.458 28.773PEI10000 25.676 23.921 24.714 24.082 29.051PEI70000 25.428 15.717 17.424 15.75 29.033通过对表2所示的五种不同流动相中检测到的色谱峰的峰形以及分离情况的比较，认为pH4.5和pH6.0 的条件分离程度较大，比较适合PEI的

18、检测。3.3流动相离子强度的影响为了优化和检验pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液作为该方法的流动相对PEI样品的响应值和分离效果，我们考察了不同浓度的流动相对PEI样品分离的影响。表3 PEI样品在不同浓度流动相中检测到的Mp（min.）Table 3 Mp (min.) of PEI samples detected in mobile phase with different concentration由表3的结果发现，增大流动相离子强度有利于减少PEI的吸附，提高样品的分离效果。在0.1 mol/L条件下，样品的分离效率很低。难以实现从分子量300到分子量10000范围内的PEI的有效分离

19、。随着离子强度的增加，不但各种样品的出峰时间提前，而且不同分子量之间的PEI的分离程度加大，实现了更有效的分离。在现有条件下，尽管离子强度大时出峰时间缩短，离子强度由0.2mol/L提高到0.3 mol/L和0.5 mol/L时的分离程度没有很大的提高。为了降低柱压保护色谱柱，保持流动相对样品的较高溶解度，我们采用比较经济的流动相浓度0.2mol/L。3.4 进样量的影响我们将PEI1800用pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液配成浓度为0.5%的样品，进样量分别为200L, 100L, 50L, 30L进行检测，结果见图2： 图2 不同进样量对样品分离的影响Figure 2 Chromatogr

20、am of PEI with different injection volume volume由图2可以看出：在该方法中，在不同的进样量下，样品的出峰时间基本不变，说明进样量对PEI样品的分离效果的影响有限。综上所述：pH4.5的缓冲溶液是检测PEI类样品分子量的最佳条件。我们采用与PEI结构接近的PEG标准样品做校正曲线。用pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液流动相配制14个PEG标样，充分溶解后进行检测，见图3：图3 PEG标准样品在pH4.5的缓冲溶液中的色谱图Figure 3 Chromatogram of PEG standard samples in HAc-NaAc buffer

21、solution with pH 4.5由图3可以看出：PEG各标样的色谱峰对称，分离较好，出峰时间也与样品的保留时间接近，可以用于校正样品的分子量。根据图3绘出校正曲线如图4所示，曲线拟合公式为logMw=3.20e-3.04T+1.16e-1T2-1.60e-3T3 （T为保留时间）曲线相关系数r2=0.9997。图4 GPC校正曲线Figure 4 Calibration curve of GPC3.5 水溶性GPC检测PEI样品的准确性和重复性我们考察了PEI10000在不同检测条件下的GPC检测结果，如表4所示：表 4 不同条件下检测的PEI10000分子量Table 4 The R

22、SD of the Mn of PEI10000 in different conditionsMeasured Time Injection volume Measured Mn PDI* Error2008.12.24 200L 11024 1.11 10.24%2009.1.13 200L 10935 1.10 9.35%2009.2.4 200L 11005 1.11 10.05%2009.2.4 100L 11394 1.09 13.94%2009.2.5 50L 11692 1.08 16.92%2009.2.5 20L 11438 1.06 14.38%*PDI：polydisp

23、ersity index分子量分布系数以上六次检测的相对标准偏差（RSD）为2.70%由表4进一步证实：在不同条件下检测PEI样品的分子量，结果非常接近，RSD只有2.70%左右，满足GPC重复性在5%左右的要求，说明本方法具有非常优秀的重复性。测量值与实际值的平均误差也在12.5%左右，说明本方法同时具有优良的准确性。4. 结论（1）通过一系列实验的考察，我们发现PEI样品在乙酸-乙酸钠缓冲溶液中的响应值较大。（2）对pH值4.08.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液进行筛选，发现pH4.5的缓冲溶液提高了色谱柱对样品的分离效率，可以明显的看出PEI聚合物样品的分子量差异。（3）增大流动相离子强度有利于减少PEI的吸附，提高样品的分离效果。（4）在该方法中，进样量对PEI样品的分离效果的影响有限。（5）pH4.5