蛋白酶液化淀粉酶活力的测定

1、第八节 蛋白酶活力的测定 一、蛋白酶酶活概述一、蛋白酶酶活概述 二、影响酶促反应速度的因素二、影响酶促反应速度的因素酶促反应动力学酶促反应动力学 三、蛋白酶活力的测定三、蛋白酶活力的测定 1、酶的定义、酶的定义 酶是由生物活细胞产生的有催化功能的蛋白质，酶是由生物活细胞产生的有催化功能的蛋白质， 只要不处于变性状态，无论在细胞内或细胞外都可只要不处于变性状态，无论在细胞内或细胞外都可 发挥催化化学反应的作用发挥催化化学反应的作用。 酶及辅酶酶及辅酶 有些酶是简单蛋白质，有些酶是结合蛋白质，有些酶是简单蛋白质，有些酶是结合蛋白质， 一般把结合蛋白质的蛋白部分称为酶蛋白，非蛋白一般把结合蛋白质的蛋

2、白部分称为酶蛋白，非蛋白 质部分称为辅酶。质部分称为辅酶。 （一）酶（一）酶 第八节 蛋白酶活力的测定 一、蛋白酶酶活概述一、蛋白酶酶活概述 （二）酶活力的测定意义（二）酶活力的测定意义 酶不易制成纯品酶不易制成纯品，会含很多杂质，真正的含酶量并不多。，会含很多杂质，真正的含酶量并不多。 所以酶制剂中所以酶制剂中酶的含量都用酶活力酶的含量都用酶活力来表示。来表示。 定性鉴定定性鉴定提取物中某一提取物中某一酶是否存在酶是否存在，一般是根据，一般是根据此酶引此酶引 起的化学反应起的化学反应来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。来判断，如检验在提取物中是否存在淀粉酶。 则用提取物与淀粉反应，一段时

3、间以后，用碘则用提取物与淀粉反应，一段时间以后，用碘- -碘化钾与反应碘化钾与反应 液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物液反应，若变蓝，说明提取物无淀粉酶活力；反之，提取物 有淀粉酶的活力。有淀粉酶的活力。 酶活力的测定：实际上是酶活力的测定：实际上是酶的定量测定酶的定量测定，酶制剂因含杂，酶制剂因含杂 质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。质多易失活等原因，故不能用称重或测量体积来定量。 （三）酶活力的概念：（三）酶活力的概念： 指酶催化特定化学反应的能力。指酶催化特定化学反应的能力。其其大小大小通常用通常用在一定在一定 条件下酶催化某一特定化学反应的速度条件下酶催

4、化某一特定化学反应的速度来表示。一定量的来表示。一定量的 酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。酶制剂催化某一化学反应速度快，活力大；反之，活力小。 速度表示法速度表示法常用常用-dS/dt或或dP/dt，测初速度，多用后者。因，测初速度，多用后者。因 为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物为反应初期底物过量，底物的减少量不容易测定，而产物 从无到有，易测定。从无到有，易测定。 酶活力又称酶活力又称酶活性酶活性。 （四）酶的活力单位（四）酶的活力单位 根据不同情况有几种酶活力单位：根据不同情况有几种酶活力单位： 国际单位国际单位IU：1961年，年，在在最适条件最适条

5、件下每分钟下每分钟转化转化 1mol底物底物所需要的酶量为一个酶活力单位所需要的酶量为一个酶活力单位。 即即1IU= 1mol/min 国际单位国际单位Kat：1972年，年，指在最适条件下指在最适条件下1秒钟内秒钟内 转化转化1mol底物所需的酶量底物所需的酶量。 即即 1 Kat=1mol/s Kat和和IU的换算关系：的换算关系：1 Kat=6107 IU， 1 IU =16.67n Kat 习惯单位习惯单位: : 在实际使用中在实际使用中, ,不同酶有各自的规定不同酶有各自的规定, ,如如: : 糖化酶活力单位糖化酶活力单位: :在规定条件下在规定条件下, ,每小时转化每小时转化 可溶

6、性淀粉产生可溶性淀粉产生1mg1mg还原糖还原糖( (以葡萄糖计以葡萄糖计) )所需的酶所需的酶 量为量为1 1个酶单位。个酶单位。 蛋白酶活力单位：规定条件下，每分钟分解蛋白酶活力单位：规定条件下，每分钟分解 底物酪蛋白产生底物酪蛋白产生11g g酪氨酸所需的酶量。酪氨酸所需的酶量。 （五）酶的比活力（五）酶的比活力 比活力（比活性）是指每单位质量样品中比活力（比活性）是指每单位质量样品中 （酶蛋白）的酶活力单位数，（酶蛋白）的酶活力单位数，即每即每 mg 蛋白质中蛋白质中 所含的所含的 U 数或每数或每 kg 蛋白质中含的蛋白质中含的 kat 数；数； 有时用单位体积中的酶活力单位表示比活

7、有时用单位体积中的酶活力单位表示比活 力。力。 酶的比活力即表示酶的含量（纯度），酶的比活力即表示酶的含量（纯度），是是 表示酶制剂纯度的一个指标。表示酶制剂纯度的一个指标。 如在酶的提纯过程中，随着酶逐步被纯化，如在酶的提纯过程中，随着酶逐步被纯化， 其比活力也在逐步增加。其比活力也在逐步增加。 （六）酶活力测定的基本原理 一般对酶的测定不是直接测定其酶蛋白浓度一般对酶的测定不是直接测定其酶蛋白浓度, 而是测定其催化化学反应的能力。这是基于而是测定其催化化学反应的能力。这是基于 在最优化条件下在最优化条件下(最适温度、最适最适温度、最适pH、最适缓冲液等、最适缓冲液等)， 当底物足够（过量，

8、当底物足够（过量， SE ） ， 在酶促反应的初始阶段，在酶促反应的初始阶段， 酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比 （即（即V=KE）。故酶活力测定的是化学反应速度，）。故酶活力测定的是化学反应速度， 一定条件下可代表酶活性分子浓度。一定条件下可代表酶活性分子浓度。 在测定酶活力时，对反应温度、在测定酶活力时，对反应温度、pH值、底物值、底物 浓度、作用时间都有统一规定，以便同类产品互相比浓度、作用时间都有统一规定，以便同类产品互相比 较。较。 酶单位并不直接反映出酶的绝对数量，它只不过酶单位并不直接反映出酶的绝对数量，它只不过 是一种相对比较的依

9、据是一种相对比较的依据。 在评价纯化酶的操作方法是优劣时，要同时考虑两个概念：在评价纯化酶的操作方法是优劣时，要同时考虑两个概念： 纯化倍数与回收率纯化倍数与回收率 纯化倍数纯化倍数= =某纯化操作后的比活力某纯化操作后的比活力/ /第一步操作后的比活力第一步操作后的比活力 回收率回收率= =某纯化操作后的总活力某纯化操作后的总活力/ /第一步操作后的总活力第一步操作后的总活力 总活力单位体积的酶活力总活力单位体积的酶活力(U/ml)分离溶液总体积分离溶液总体积(ml) （七）酶活力的测定方法（七）酶活力的测定方法（动力学法动力学法） 酶活力与底物浓度、酶浓度、酶活力与底物浓度、酶浓度、pH、

10、温度、激活剂、抑、温度、激活剂、抑 制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测制剂的浓度以及缓冲液的种类和浓度都密切相关。酶活性测 定可用定可用终止反应法或连续反应法（终止反应法或连续反应法（动力学法动力学法）。 1 终止反应法终止反应法(Stopped Method) 终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应终止反应法是将酶反应按时间即刻完全停止，取出反应 物或产物，予以分离，再确定反府物的消耗量，或产物的形物或产物，予以分离，再确定反府物的消耗量，或产物的形 成量，算出酶活性。产物的测定方法可用成量，算出酶活性。产物的测定方法可用酶法、化学法或放酶法、化学法或放 射化学法

11、射化学法。 使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也使酶停止作用常用强酸、强碱、三氯乙酸或过氯酸，也 可用可用SDS）使酶失活或加热使酶变性等。）使酶失活或加热使酶变性等。 （1）酶法）酶法 酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用酶法是用其他纯酶将产物直接或间接转变成一个可用分光分光 光谱仪或荧光光谱仪测定光谱仪或荧光光谱仪测定的化合物。通常采用偶联法，例如的化合物。通常采用偶联法，例如 葡萄糖氧化酶催化的下列反应：葡萄糖氧化酶催化的下列反应： 葡萄糖葡萄糖+O2葡萄糖内脂葡萄糖内脂+H2O2 欲测定葡萄糖内脂和欲测定葡萄糖内脂和H2O2均较困难，可在该反应中加入过氧均较困难，

12、可在该反应中加入过氧 化物酶和木酚，使发生下列反应化物酶和木酚，使发生下列反应: 由于由于4甲氧联酚在甲氧联酚在435nm波长处有光吸收峰，因此、只波长处有光吸收峰，因此、只 要测定要测定A435，就可知，就可知4甲氧联酚的量，可得甲氧联酚的量，可得H202的量，从而的量，从而 可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶可推知酶活力。在这种方法中，偶联酶(过氧化物酶过氧化物酶)必须过必须过 量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在量，否则，将出现下图的情况。一般偶联酶量最少也应在5 倍以上。倍以上。 偶联法中偶联酶对反应速度的影响偶联法中偶联酶对反应速度的影响 再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激

13、酶）：再如：测定己糖激酶（或葡萄糖激酶）： 葡萄糖葡萄糖ATP葡萄糖葡萄糖-6-P 其偶联其偶联-指示剂指示剂 为葡萄糖为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶 葡萄糖葡萄糖-6-P+NADP+ 6-P-葡萄糖酸葡萄糖酸+NADPH+H+ 这时即可测定这时即可测定340nm处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄处光吸收的增加得到己糖激酶（或葡萄 糖激酶）的活性糖激酶）的活性. 酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。酶偶联测定法可用分开的也可用连续的反应系统进行。 （2）化学法化学法 化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理化学法是利用化学反应使产物转变成一个可用某种物理 方法测出方法测

14、出NH3和和CO2，然后用，然后用比色法、滴定法、气体体积量度比色法、滴定法、气体体积量度 法法等方法测出酶活性等方法测出酶活性. 化学分析法的优点是化学分析法的优点是: :不需要特殊仪器不需要特殊仪器, ,一般有恒温水浴、一般有恒温水浴、 滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于滴定管、离心机及比色计或分光光度计即可进行工作。对于 绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体绝大多数的酶，都可根据底物及产物的化学性质，设计具体 的测定方法，应用范围较广。的测定方法，应用范围较广。 缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所得，缺点是：由于测定结果是根据间隔一定时间取样所

15、得， 取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反取样过多，则总的工作量较大，取样过少，则不能得到酶反 应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不应过程的全貌，并且在实际操作过程中，取样及停止时间不 容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。容易准确控制，因此对于反应较快的酶反应，结果不够准确。 目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、目前，市场上已有酶反应仪商品，可将不同时间取样、 停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排停止反应、加入反应试剂、保温、比色或其他测定方法编排 成程序，自动的依次完成，并将其结果打印输出。所以现在成程序，自动的依

16、次完成，并将其结果打印输出。所以现在 对化学分析法必须作出新的评价。对化学分析法必须作出新的评价。 （3）放射性化学法）放射性化学法 是由具有放射性的产物上测出全放射量，是由具有放射性的产物上测出全放射量， 再算出产物量，从而计算出酶的活性再算出产物量，从而计算出酶的活性. . 优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定，优点是：灵敏，可直接应用于酶活力测定， 也可用于体内酶活性测定，特别适用于低浓度的也可用于体内酶活性测定，特别适用于低浓度的 酶和底物的测定。酶和底物的测定。 缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应缺点是：操作烦琐，样品需要分离，反应 过程无法连续跟踪，并且同位素对人体有损伤作过程无

17、法连续跟踪，并且同位素对人体有损伤作 用。此外，辐射淬灭会引起测定误差，如用。此外，辐射淬灭会引起测定误差，如3H发发 射的射线很弱，甚至会被纸吸收。射的射线很弱，甚至会被纸吸收。 2 连续反应法连续反应法(Continuous Method) 连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸连续反应法无需终止反应而是基于酶反应过程中的光谱吸 收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化用仪器跟踪检测 反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便，反应进行的过程，记录结果，算出酶活性，连续法使用方便， 一个样品可多次测定，且有利于一个

18、样品可多次测定，且有利于动力学研究动力学研究，但很多酶还不能，但很多酶还不能 用该法测定。用该法测定。 （1）一般的连续法一般的连续法：包括：包括光谱吸收、电化学、量气、量热、光谱吸收、电化学、量气、量热、 旋光法旋光法等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光等，其中以光谱吸收较为准确。光谱吸收主要指分光光 度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪度和荧光法。该法适用于一些反应速度较快的酶，自动记录仪 的普遍使用使该法更容易被人们所接受。的普遍使用使该法更容易被人们所接受。 下表即是几种连续法的例子：下表即是几种连续法的例子： （2）偶联的连续法）偶联的连续法 是将指示酶

19、直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或是将指示酶直接加到待测酶反应系统中，将其产物直接或 间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必间接转变成可用光谱吸收仪检测的化合物。连续的偶联反应必 须在酶反应相同条件（须在酶反应相同条件（pH、温度等）下进行，且加入的指示、温度等）下进行，且加入的指示 酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。酶以及其他各种物质不能干扰原来的酶活力。 如醛缩酶如醛缩酶(Aldolase)催化催化1，6二磷酸果糖生成二磷酸果糖生成3-P甘油甘油 醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出醛和磷酸二羟丙酮的反应，这些产物都无法直接测出.用磷酸用磷酸 丙糖异构

20、酶丙糖异构酶(Triose Phosphate lsomerase)来作偶联酶来作偶联酶 (Coupling Enzyme)， 甘油甘油1P脱氢酶脱氢酶(Glycerol-1- Phosphate Dehydrogenase)来作指示酶依据来作指示酶依据NNADH变成变成NAD+ 的光谱变化来算出醛缩酶活性。的光谱变化来算出醛缩酶活性。 如下图：如下图： 醛缩酶以醛缩酶以lP甘油脱氢酶甘油脱氢酶 为指示酶的偶联测定酶活性法为指示酶的偶联测定酶活性法 3、酶活力测定中应注意的几个问题酶活力测定中应注意的几个问题 酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件下进酶反应和一般化学反应一样，都是在一定条件

21、下进 行的，但酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物行的，但酶反应要比一般化学反应复杂得多，除了反应物 以外，还有酶这样一个决定性因素。因此，酶活性测定除以外，还有酶这样一个决定性因素。因此，酶活性测定除 了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的了必须遵照所用分析化学方法的操作要求外，又有它的 些特点。些特点。 首先测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度首先测定的酶反应速度必须是初速度，只有初速度 才与底物浓度成正比。初速度的确定一般指：底物消耗才与底物浓度成正比。初速度的确定一般指：底物消耗 量在量在5以内，或产物形成量占总产物量的以内，或产物形成量占总产物量的15以下时的以下

22、时的 速度。速度。 其次，底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度其次，底物浓度、辅因子的浓度必须大于酶浓度 (即过饱和即过饱和)，否则，底物浓度本身是，否则，底物浓度本身是个限制因子，此时个限制因子，此时 的反应速度是两个因素的复变函数。的反应速度是两个因素的复变函数。 第三，反应必须在酶的最适条件第三，反应必须在酶的最适条件(如最适温度、如最适温度、PH 和离子强度等和离子强度等)下进行。此外，测定酶活性所用试剂中不下进行。此外，测定酶活性所用试剂中不 应含有酶的激活剂、抑制剂；应含有酶的激活剂、抑制剂； 同时底物本身不要有裂解。用反应速度同时底物本身不要有裂解。用反应速度(v)对酶浓度对酶浓

23、度 ( E)作图，应得一条通过原点的直线，即作图，应得一条通过原点的直线，即v为（为（E）的线性）的线性 函数。函数。 初速度的确定是在底物浓度初速度的确定是在底物浓度(S)足够的条件下，通过足够的条件下，通过E 的变化来确定的变化来确定 如下图如下图.由图可见，当分别采用不同的酶浓度时，由图可见，当分别采用不同的酶浓度时， 测得反应量对时间的变化。测得反应量对时间的变化。 求得几个适当时间的反应速度求得几个适当时间的反应速度(反应量反应时间反应量反应时间)。再用。再用 反应速度对酶量作图反应速度对酶量作图 。由图可见其中，。由图可见其中，5min时测得的数据时测得的数据 可用于求出初速度，若

24、以可用于求出初速度，若以10min以上数据时，测得的酶活性偏以上数据时，测得的酶活性偏 低。低。 （七）酶活力的测定方法（七）酶活力的测定方法（使用仪器分类）（使用仪器分类） 1 1、分光光度法：、分光光度法：产物与适当的化学试剂生成有色物质产物与适当的化学试剂生成有色物质 或产物有紫外吸收的能力可采用此法。或产物有紫外吸收的能力可采用此法。 2 2、测压法：、测压法：产物中有气体，测气压增加量。产物中有气体，测气压增加量。 3 3、滴定法：、滴定法：产物中有酸生成，用碱滴定。产物中有酸生成，用碱滴定。 4 4、荧光法：、荧光法：产物中有荧光物质生成或产物与荧光试剂产物中有荧光物质生成或产物与

25、荧光试剂 反应生成荧光产物可用此法。反应生成荧光产物可用此法。 5 5、旋光法：、旋光法：产物中有旋光物质可采用此法。产物中有旋光物质可采用此法。 除了以上方法外，还可根据除了以上方法外，还可根据产物的性质产物的性质采用其它方法。采用其它方法。 二、影响酶促反应速度的因素酶促反应动力学二、影响酶促反应速度的因素酶促反应动力学 酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其酶促反应动力学：研究酶促反应速度及其 影响因素的科学。影响因素的科学。 1.酶浓度酶浓度E 2.底物浓度底物浓度S 3.反应温度反应温度 4.pH值值 5.激活剂激活剂 6.抑制剂抑制剂 v E o 在在有有足够底物足够底物和其他条件不

26、变、无任何和其他条件不变、无任何 不利因素的情况下：不利因素的情况下： （一）酶浓度对酶作用的影响（一）酶浓度对酶作用的影响 v = k E v Vm 0.3 0.2 Vm 2 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 S S与与v关系：关系： 当当S很低时，很低时，S 与与v 成比例成比例- 一级反应一级反应 当当S较高时，较高时，S 与与v 不成比例不成比例-混合级反应混合级反应 当当S很高时，很高时，S ，v不变不变-零级反应零级反应 （二）底物浓度对酶作用的影响（二）底物浓度对酶作用的影响 （三）（三）pH对酶作用的影响对酶作用的影响 2. 最适最适pH 1. pH稳定性稳定性 酶表

27、现最大活力的酶表现最大活力的pH值。值。 在一定的在一定的pH范围范围 内酶是稳定的。内酶是稳定的。 一些酶的最适一些酶的最适 pH pH 值值 酶酶 最适最适 pHpH 胃蛋白酶胃蛋白酶 1.81.8 过氧化氢酶过氧化氢酶 7.67.6 胰蛋白酶胰蛋白酶 7.77.7 延胡索酸酶延胡索酸酶 7.87.8 核糖核酸酶核糖核酸酶 7.87.8 精氨酸酶精氨酸酶 9.89.8 酶的最适酶的最适pH只在只在 一定条件下才有一定条件下才有 意义意义 酶的最适酶的最适pH 不是固定的常数不是固定的常数, 其数值受酶的纯其数值受酶的纯 度、底物种类和度、底物种类和 浓度、缓冲液种浓度、缓冲液种 类和浓度等

28、影响类和浓度等影响 pH影响酶活力的原因影响酶活力的原因： 1. 环境过酸、过碱可使酶的空间结构破坏， 引起酶构象的改变，酶变性失活； 2. pH改变能影响酶分子活性部位上有关基团 的解离，从而影响与底物的结合或催化； 3. pH影响底物有关基团的解离。 （四）温度对酶作用的影响（四）温度对酶作用的影响 两种不同影响：两种不同影响： 1. 温度升高，反温度升高，反 应速度加快应速度加快； 2. 温度升高，热温度升高，热 变性速度加快变性速度加快。 T v 最适温度最适温度 酶的最适温度酶的最适温度: : 在一定条件下，酶表现在一定条件下，酶表现最最 大大活力时的温度。活力时的温度。 酶的最适温

29、度不是一个固定的常数，其数酶的最适温度不是一个固定的常数，其数 值受底物种类、作用时间等因素影响而改变。值受底物种类、作用时间等因素影响而改变。 （五）激活剂对酶作用的影响（五）激活剂对酶作用的影响 凡能提高酶活力的物质都称之为该酶的激凡能提高酶活力的物质都称之为该酶的激 活剂。如活剂。如Cl-是唾液淀粉酶的激活剂。是唾液淀粉酶的激活剂。 激激 活活 剂剂 无机离子无机离子 大多为金属离子大多为金属离子:如如K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+ 等等 少数为阴离子少数为阴离子:如如Cl-,Br-,I-,CN-,PO43- 等等 小分子有机物小分子有机物：如如Vc, C

30、ys, GSH, 胆汁酸盐等胆汁酸盐等 生物大分子生物大分子：如蛋白激酶，激活酶原的蛋白酶等如蛋白激酶，激活酶原的蛋白酶等 （六）抑制剂对酶作用的影响（六）抑制剂对酶作用的影响 使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学使酶的必需基团或活性部位中的基团的化学 性质改变而降低酶活力甚至使酶丧失活性的物质，性质改变而降低酶活力甚至使酶丧失活性的物质， 称为称为抑制剂（抑制剂（ inhibitor, I）。 由抑制剂所引起的酶活力降低或丧失称为由抑制剂所引起的酶活力降低或丧失称为抑抑 制作用（制作用（inhibition）。 凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用

31、称为称为失活作用（失活作用（inactivation）。 1. 不可逆抑制作用不可逆抑制作用 ( 抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的，抑制剂与酶的结合（共价键）是不可逆的，不能用透析、不能用透析、 超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性。超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性。 S + EESE + P + I EI 2. 可逆抑制作用可逆抑制作用 抑制剂与酶以非共价键结合引起酶活性的降抑制剂与酶以非共价键结合引起酶活性的降 低或丧失低或丧失, , 结合是可逆的结合是可逆的, , 能够通过透析、超滤能够通过透析、超滤 等物理方法使酶恢复活性。等物理方法使酶恢复活性。 抑制程度由酶与抑制剂之间的亲

32、和力大小、抑制程度由酶与抑制剂之间的亲和力大小、 抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。抑制剂的浓度以及底物的浓度决定。 I I 抑制剂必须在酶与底抑制剂必须在酶与底 物结合后才能进一步物结合后才能进一步 形成形成ESI复合物。复合物。 蛋白酶能水解蛋白质为氨基酸。其制剂广蛋白酶能水解蛋白质为氨基酸。其制剂广 泛应用于发酵食品、皮革脱毛、丝绸脱胶、医药泛应用于发酵食品、皮革脱毛、丝绸脱胶、医药 生产中。蛋白酶按其作用生产中。蛋白酶按其作用pH值不同分为值不同分为碱性蛋碱性蛋 白酶白酶、中性蛋白酶中性蛋白酶和和酸性蛋白酶酸性蛋白酶等。其等。其活力测定活力测定 方法基本相同方法基本相同，区别仅在于作用的

33、，区别仅在于作用的pH值值不同。不同。 三、蛋白酶活力的测定三、蛋白酶活力的测定 1、原理：、原理： 蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱 性条件下使福林性条件下使福林-酚试剂还原，生成鉬蓝与钨酚试剂还原，生成鉬蓝与钨 蓝，以比色法测定。蓝，以比色法测定。 2、试剂及仪器、试剂及仪器 （1） 福林福林酚试剂酚试剂 称取称取50g钨酸钠钨酸钠(Na2WO42H2O)，12.5g钼酸钠钼酸钠 (Na2MoO42H2O)，置入，置入1000mL原底烧瓶中，加原底烧瓶中，加350mL 水，水，25mL85%磷酸，磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流浓盐酸，文火微沸回流

34、10h， 取下回流冷凝器，加取下回流冷凝器，加50g硫酸锂硫酸锂(Li2SO4)和和25mL水，混匀水，混匀 后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱，驱 除残余的溴，冷却，用除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用 水稀释至水稀释至500mL。 使用时用使用时用2倍体积的水稀释。倍体积的水稀释。 （2） 0.4mol/L碳酸钠溶液碳酸钠溶液：称取：称取42.4g碳酸碳酸 钠，用水溶解并定容至钠，用水溶解并定容至1000mL。 （3） 0.4mol/L三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液：称取：称取65.5g三三

35、氯乙酸，用水溶解并定容至氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。 （4） 2%酪蛋白溶液酪蛋白溶液：称取：称取2.00g酪蛋白酪蛋白(又又 名干酪素名干酪素)，加约，加约40mL水和水和23滴浓氨水，于沸滴浓氨水，于沸 水浴中加热溶解，冷却后，用水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶磷酸缓冲溶 液稀释定容至液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。，贮存于冰箱中。 （5） pH7.2磷酸缓冲液磷酸缓冲液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢磷酸二氢 钠钠(NaH2PO42H2O)，用水溶解稀释至，用水溶解稀释至1000mL； 0.2mol/L 磷酸氢

36、二钠溶液：称取磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠磷酸氢二钠 (Na2HPO412H2O)，用水溶解稀释至，用水溶解稀释至1000mL； pH7.2磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液(0.02mol/L)：取：取28mL 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液和磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水磷酸氢二钠溶液，用水 稀释至稀释至1000mL。 pH6.0磷酸缓冲溶液磷酸缓冲溶液(0.02mol/L)：0.2mol/L Na2HPO412.3mL、0.2mol/L NaH2PO487.7mL。 取取87.7mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和磷酸二氢钠溶液和12.3mL 0.2

37、mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。 （6） 标准酪氨酸溶液标准酪氨酸溶液(100 g/mL)： 准确称取准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量酪氨酸，加少量0.2mol/L 盐酸溶液盐酸溶液(取取1.7mL浓盐酸，用水稀释至浓盐酸，用水稀释至100mL)， 加热溶解，用水定容至加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含，每毫升含DL-酪酪 氨酸氨酸100 g。 （7） 仪器仪器：分光光度计、离心机、离心管、：分光光度计、离心机、离心管、 具塞试管具塞试管 3、实验步骤、实验步骤 （1） 标准曲线绘制标准曲线绘制 取取9支试管，按下表将标准酪氨酸溶液稀释

38、。支试管，按下表将标准酪氨酸溶液稀释。 编编 号号012345678 标准酪氨酸溶液标准酪氨酸溶液 (mL)100 g/mL 012345678 水水 (mL)1098765432 稀释酪氨酸溶液稀释酪氨酸溶液 浓度浓度 ( g/mL) 010203040 50 60 7080 在上述各管中各取在上述各管中各取1mL，分别加入，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，碳酸钠溶液，1mL福林福林酚试剂，于酚试剂，于 400C水浴显色水浴显色20min，在，在680nm波长下测吸光度，波长下测吸光度， 绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时时 相当的酪

39、氨酸相当的酪氨酸 g数，即为数，即为K值。值。 （2） 酶液的制备酶液的制备 准确称取酶粉准确称取酶粉2g，用，用pH7.2磷酸缓冲溶液定磷酸缓冲溶液定 容至容至200mL，置入，置入400C水浴浸取水浴浸取0.5h，用纱布过，用纱布过 滤。根据酶活力的高低，再用滤。根据酶活力的高低，再用pH7.2磷酸缓冲溶磷酸缓冲溶 液稀释一定倍数液稀释一定倍数(使其测定的吸光度在使其测定的吸光度在0.20.4范范 围内为宜围内为宜)。 （3） 测定测定 取四只取四只10mL离心管，分别加入离心管，分别加入1mL稀释酶液，其中一支稀释酶液，其中一支 为空白管，三只为平行试管。置入为空白管，三只为平行试管。置

40、入400C水域中预热水域中预热35min，在，在 三只平行试管中分别加入三只平行试管中分别加入1mL2%酪蛋白溶液，准确计时保温酪蛋白溶液，准确计时保温 10min。立即加入。立即加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，三氯乙酸溶液，15min后离心分后离心分 离或用滤纸过滤。分别吸取离或用滤纸过滤。分别吸取1mL清液，加清液，加5mL0.4mol/L碳酸钠溶碳酸钠溶 液，最后加入液，最后加入1mL福林福林酚试剂，摇匀，于酚试剂，摇匀，于400C水浴中显色水浴中显色 20min。 空白管中先加入空白管中先加入2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液，再加三氯乙酸溶液，再加 1mL2% 酪蛋白溶液，酪

41、蛋白溶液，15min后离心分离或用滤纸过滤。吸取后离心分离或用滤纸过滤。吸取 1mL清液，加清液，加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，最后加入碳酸钠溶液，最后加入1mL福林福林 酚试剂，摇匀，于酚试剂，摇匀，于400C水浴中显色水浴中显色20min。 以空白为对照，在以空白为对照，在680nm波长下测吸光度，取其平均值。波长下测吸光度，取其平均值。 4、计算、计算 蛋白酶活力单位的定义：蛋白酶活力单位的定义：1g酶粉，在酶粉，在40，pH7.2 下，每分钟水解酪蛋白为酪氨酸的微克下，每分钟水解酪蛋白为酪氨酸的微克( g)数。数。 W NEK 1 10 4 蛋白酶活力 式中： E一空白为对照的

42、三支平行试管的平均吸光度一空白为对照的三支平行试管的平均吸光度 4离心管中反应液的总体积，离心管中反应液的总体积，mL 10反应时间反应时间10min N稀释倍数稀释倍数 W酶粉称取量，酶粉称取量，g 液化型淀粉酶液化型淀粉酶(又称又称 -1,4糊精酶，俗称糊精酶，俗称 -淀淀 粉酶粉酶)能水解淀粉中能水解淀粉中 -1,4葡萄糖苷键，水解淀粉葡萄糖苷键，水解淀粉 为分子量不一的糊精，淀粉迅速被液化。使淀粉为分子量不一的糊精，淀粉迅速被液化。使淀粉 与碘呈蓝紫色特征反应逐渐消，以该颜色的消失与碘呈蓝紫色特征反应逐渐消，以该颜色的消失 速度计算酶的活力的高低。速度计算酶的活力的高低。 第九节 液化

43、型淀粉酶活力测定 一、原理一、原理 二、试剂二、试剂 1、稀碘液稀碘液 称取碘称取碘11g，KI 22g，先用少量蒸馏水试点完全溶液，先用少量蒸馏水试点完全溶液 后定容至后定容至500mL，储存于棕色瓶内备用。，储存于棕色瓶内备用。 吸取上述溶液吸取上述溶液2mL，加碘化钾，加碘化钾20g，用蒸馏水溶解定，用蒸馏水溶解定 容至容至500mL即为稀碘液，储存于棕色瓶内。即为稀碘液，储存于棕色瓶内。 2、2%可溶性淀粉溶液可溶性淀粉溶液 准确称取可溶性淀粉准确称取可溶性淀粉2.000g(预先在预先在100105 C烘干烘干)， 加少量水调匀，倾入加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明。冷沸水中，继续煮沸至透明。冷 却后用水定容至却后用水定容至100mL。 3、0.02mol/L pH6.0的磷酸氢二钠的磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液 称取称取Na2HPO412H2O45.23g和柠檬酸和柠檬酸(C6H8O7H2O) 8.07g,用蒸馏水溶解定容至用蒸馏水溶解定容至1000mL。 4、标准终点比色液标准终点比色液 A、 精确称取氯化钴精确称取氯化钴(CoCl26H2O)40.243g和重铬酸钾和重铬酸钾 (K2Cr2O7)0.487