分子标记辅助选择育种

1、分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种传统的育种主要依赖于植株的表现型选择(Phenotypieal selection) o环境条件、基因间互作、基因型与环境 互作等多种因素会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病的条 件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、 鉴定工作更困难。一个优良品种的培育往往需花费78年甚至十几年 时间。如何提高选择效率，就是育种工作的关键。育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选 择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标 记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的 紫色叶鞘等形

2、态性状标记,在育种工作中曾得到一定的应用。以非整倍 体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记， 在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴 定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。生化标记主要就 是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型 差异。它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。但就是它们多态 性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足 遗传育种工作需要。以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗 传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分 析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面

3、得到广泛应用，尤其就是分子标记 辅助选择(molecular marker-assisted selection, MAS)育种更受到 分子标记辅助选择育种人们的重视。第一节分子标记的类型与作用原理一、分子标记的类型与特点按技术特性，分子标记可分为三大类。第一类就是以分子杂交 为基础的DNA标记技术,主要有限制性片段长度多态性标记 (Restriction fragment length polymorphisms, RFLP 标记)；第二类就 是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR反应)为基础 的各种DNA指纹技术。PCR就是Mullis等(1985

4、)首创的在模板DNA、引 物与4种脱氧核糖核昔酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的体外酶促 反应，合成特异DNA片段的一种方法。PCR技术的特异性取决于引物与模 板DNA的特异结合。PCR反应分变性(denaturation)、复性(annealling) 延伸(exten一sion)三步(图171) o变性指的就是通过 加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程;复性(又 称退火)就是指当温度降低时，单链DNA回复形成双链的过程，由于模板 分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA大大高于模板 DNA,容易使引物与其互补的模板在局部形成杂交链;延伸就是指在DNA 聚合

5、酶与4种脱氧核糖核昔三磷酸底物及MQ存在的条件下，在聚合酶 催化下进行以引物为起始点的5-3*的DNA链延伸。以上三步为一个循 环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，经2530个循环后，介 于两个引物之间的特异DNA片段得到大量的复制，数量可达2X106-7拷 贝。按照PCR所需引物类型又可分为:单引物PCR标记,其多态性来源 分子标记辅助选择育种于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩增多态 性 DNA 标记(Random 别 amplification polymorphism DNA, RAPD)、简单 重复序列中间区域标记(inter-simple sequenc

6、e repeats polymorphisms, ISSR)等技术;双引物选择性扩增的PCR标 记,主要通过引物3端碱基的变化获得多态性，这种标记主要指扩增片 段长度多态性标记(Amplified fragment lengthpolymorphisms, AFLP);需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的PCR标记如简单序列重复标 记(Simple sequence repeats, SSR) 序列特征化扩增区域(Segion,简 称SCAR技术)与序标位(Sequence一tagged sites,简称STS)等。第三类 就是一些新型的分子标记，如单核昔酸多态性(Single nucleot

7、ide polymorphism, SNP),由基因组核昔酸水平上的变异引起的DMA序列多态 性,包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入/缺失等。表达序列标 签(Expressed sequences tags, EST)就是在eDMA文库中随机挑选克隆， 并进行单边测序(Singlepass sequence)而产生的300500bp的核昔 酸片段。应用于分子标记辅助育种的标记主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。它们的遗传、表现特点总结于表17-lo分子标记辅助选择育种塞一亠 LXQ竿,分子标记就是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点:表现 稳定，多态性直接以DNA形式表

8、现,无组织器官、发育时期特异性，不受 环境条件、基因互作影响;数量多，理论上遍及整个基因组;多态性 高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大 量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；对目标性状表达无 不良影响，与不良性状无必然连锁;部分标记遗传方式为共显性，可鉴 别纯合体与杂合体;成本不就是太高,一般实验室均可进行。对于特定 探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成。二、分子标记的原理与遗传特性()RFLP变性及引一引初延f电E产拘片踐及弓I 合阪4图17 - 1 PCR扩增尿理囲分子标记辅助选择育种发现最早，目前应用最为广泛的一种分子标记。这一类标记在 20世

9、纪70年代已被发现。1980年，人类首先将其用于构建连锁图。目 前,该技术已广泛用于动植物连锁图的构建、重要农艺性状基因的分子 标记等。1.RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的碱基替换、插人、缺失 或重复等，造成某种限制性内切酶(restriction enzymes,简称RE)酶切 位点的增加或丧失就是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个 DNA / RE组合而言，所产生的片段就是特异性的,它可作为某一 DNA所特 有的“指纹”。某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，能产生数 百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将 它们按原来的顺序与位置转移至易于操作

10、的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，分子标记辅助选择育种 39 兰NK-3K90H5维e t n X.-aJt老卜fc幺S52iy配3彳513芝&當h2S?(ZH1X15Q乎S9S9亘sitMesitMe三ztfJW层Mfeff*Mfeff* YSK13YSK13 韋乔天曲CMUCMUm mrbMrbMzz挥一密畫亠倉tulg:tulg:佟虫M M伏崔一EE龙settc;7wnrtttesettc;7wnrtttesxt爲sIEtra H3UJi HWAfcopjijuu1992gfiS ru召工liin M. el al Taiitz imii.&(IdYH1g*WagJJfxN*宅&b&b KMKM

11、 芙沦 ofuHIMofuHIMwbsp-wbsp- assessassess 耀加?=显s s换牡卅底授册4!y4!y恋H-$lH-$l州-izj-izj用放射性同位素（如”p）或非放射性物质（如生物素、地高辛等）标记的 DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交（即Southern杂交），若某一位置上 的DNA酶切片段与探针序列相似,或者说同源程度较高，则标记好的探针分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种DNAftSH用放射性同位耒标id DNA就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，即可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况（图17-2）o对于线粒体与叶绿体等相对较小的DNA分子

12、，通过合适的限制 性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差异,就不需 Southern 杂交。RFLP分析的探针,必须就是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能 显示清晰可辨的带型，表现为弥散状,不易进行观察分析。RFLP探针主要 有三种来源，即cDNA克隆、植物基因组克隆（Random Genome克隆，简称 RG克隆）与PCR克隆。图17-2 RFLP分析流程图提駅莽因 组DMA限制性内切降 琼脂練磁 Southern 用打旳的魁输 髀斛DMA电泳神印DN人预杂交5-ACiTGATTTACG 35 -ACGTiATITAi3， t/KCTAf AG$3-r?ACTA AATGC

13、yAAC； TI5-/ TGATTTigkM AGTGATTTGJ3 -TGCACTA- AATGC分子标记辅助选择育种2. RFLP标记的特点标记的特点 RFLP标记具有共显性的特点标记具有共显性的特点。共显性。共显性 （co-dominant）标记指的就是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段 均在F,中表现。它已被广泛用于多种生物的遗传分析，特别就是构建植 物遗传图谱。RFLP标记所需DNA量大（515鹏），检测步骤繁琐，需要的仪 器、设备较多,周期长，检测少数几个探针时成本较高，用作探针的DNA 克隆其制备与存放较麻烦；检测中要利用放射性同位素（通常为少）,易 造成污染。尽管非放射性物质

14、标记方法可用，但价格高，杂交信号相对较 弱,灵敏度也较同位素标记低。目前,RFLP标记直接用于育种成本高，人 们正致力于将RFLP标记转化为PCR标记，便于育种上利用。（二）RAPD 标记1. RAPD标记的原理 Williams等（1990）以DNA聚合酶链式 反应为基础而提出的。所谓RAPD标记就是用随机排列的寡聚脱氧核昔 酸单链引物（长度为10个核昔酸）通过PCR扩增染色体组中的DNA所获 得的氏度不同的多态性DNA片段。RAPD标记的原理同PCR技术,但又有 别于常规的PCR反应。主要表现在以下3个方面：引物。常规的PCR 反应所用的就是一对引物，长度通常为20bp（碱基对）左右;RA

15、PD所用的 引物为一个,长度仅lObpo反应条件。常规的PCR复性温度较高，一般 为5560C,而RAPD的复性温度仅为36C左右。扩增产物。常规PCR 产物为特异扩增，而RAPD产物为随机扩增。这样,RAPD反应在最初反应 周期中，由于短的随机单引物,低的退火温度，一方面保证了核昔酸引物分子标记辅助选择育种与模板的稳定配对，另一方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对的随机性,提高了基因组DNA分析的效率。原理上与RAPD相似的还有APPCR(Arbitrarilyprimed polymerae chain reaction) o AP一PCR 指在

16、PCR 反应中使用 的引物长度与一般PCR反应中的引物相当,但在反应开始阶段退火温度 较低，允许大量错配，因此可引发随机的扩增。一般在AP-PCR反应中应 用放射性标记，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后通过放射自显影， 检测其多态性。2. RAPD标记的特点如果基因组在特定引物结合区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致特定引物结合位点分布发生 相应变化，导致PCR产物增加、缺少或分子量大小的变化。若PCR产物 增加或缺少，则产生显性的RAPD标记;若PCR产物发生分子量变化则产 生共显性的RAPD标记，通过电泳分析即可检测出基因组DNA在这些区域 的多态性。RAPD标记一般表现为

17、靠性遗传,极少数表现为共显性遗传。 显性标记指的就是F】的多态性片段与亲本之一完全一样，这样在杂交组 合后代中扩增产物的记录可记为“有/无”，即把每一随机扩增多态性 片段作为分子图谱的一个位点。RAPD引物长一般为10个碱基，人工合成成本低,一套引物可用 于不同作物,建立一套不同作物标准指纹图谱。RAPD可以方便用于种质 资源指纹档案建立，种内遗传多样性分析与品种纯度鉴定。因此RAPD也 分子标记辅助选择育种就是一种潜力很大的分子标记。由于使用DNA扩增仪，操作自动化程度高，分析量大，且免去了 RFLP中的探针制备、同位素标记、Southern印迹等步骤，分析速度很快。 RAPD分析所需DNA

18、样品量少（一般510ng）,对DMA质量要求较RFLP低。 同时,RAPD标记还可转化为RFLP探针,SCAR及STS等表现为共显性与显 性的分子标记。RAPD最大缺点就是重复性较差。RAPD标记的实验条件摸索与 引物的选择就是十分关键而艰巨的工作。为此研究人员应对不同物种做 大量的探索工作，以确定每一物种的最佳反应程序包括模板DNA、引物、 MQ浓度等。只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。3. SCAR标记 在RAPD技术的基础上，1993年,Paran等提出 了一种将RAPD标记转化成特异序列扩增区域标记，即SCAR标记。它的 基本原理就是：目标DNA经RAPD分析后，将RA

19、PD多态片段克隆一对克隆片段两端测序一根据测序结果设计长为1824bp的引物，一般引物 前10个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物。多态性片段克隆之前 首先应从凝胶上回收该片段，由于Taq酶可使PCR产物3,末端带上A尾 巴,人工设计的克隆载体5,末端有一个突出的T碱基，这样可使PCR产物 高效地克隆到载体上。将连接产物转化大肠杆菌，涂平板，挑选重组克隆, 测序分析、设计引物,PCR扩增，检测就是否还能扩增出原来的多态性条 带。这种转化成功的标记就称为SCAR标记。由于SCAR标记所用引物长, 特异性扩增重复性好，可有效的用于分子育种。分子标记辅助选择育种(三)AFLP它就是荷兰Keyge

20、ne公司科学家Marc & Pieter 1993年创 造发明的一种DNA分子标记。该技术就是对限制性酶切片段的选择性扩 增，又称基于PCR的RFLPo鉴于AFLP标记的多态性强,一次可检测到 100-150个扩增产物,因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的 研究。1. AFLP标记的原理首先对基因组的DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高的限制性内切酶(frequent cutter),另一种为酶切 频率较低的酶(rare cutter) o用酶切频率较高的限制性内切酶消化基 因组DNA就是为了产生易于扩增的,且可在测序胶上能较好分离出大小 合适的短DNA片段;用后者消化基因组DNA就

21、是限制用于扩增的模板DNA 片段的数量。AFLP扩增数量就是由酶切频率较低的限制内切酶在基因组 中的酶切位点数量决定的。将酶切片段与含有与其黏性末端相同的人工 接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反 应的引物结合位点,通过选择在末端上分别添加13个选择性碱基的不 同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实 现特异性扩增，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。AFLP的 原理示意图见图17-3o AFLP分析的基本步骤可以概括为：(1) 将基因组DNA同时用2种限制性核酸内切酶进行双酶切后, 形成分子量大小不等的随机限制性片段,在这些DNA片段两

22、端连接上特 定的寡核昔酸接头(oligo nucleotide adapters) o分子标记辅助选择育种(2) 通过接头序列与PCR引物3末端的识别，对限制性片段进 行选择扩增。一般PCR引物用同位素32P或33P标记。(3) 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特异扩增限制性片段。(4) 将电泳后的凝胶转移吸附到滤纸上，经干胶仪进行干胶处 理。(5) 在X光片上感光,数日后冲洗胶片并进行结果分析。分子标记辅助选择育种AATTCCCAGGGTrestricticm tragmcn!TGGT ACCAGCEcoRi adaptoradapcor I igai ionTaql adaptorCTCGrAGAC

23、IGCGTACCAATTCCCACTGACGCATGGTTAAGCiGTKiGTCGCTCAGGACTCA I ACCAGCCAGTCCTGAGTAWAGAFLP primerCTCGTAGACIGCGTACCAATTCCCAGAGC A TCTGACGCATJTTAAGGGTCTCGTAGACTGCGTACCAATTCCCAACCAGCCAGTCCTGAGTAGC/G08W2OW細JAMCAampltficatiomno amplitlcatBonsc|CiMc banAFLP primersclccdvc basesra 17-3 AFLP那理及扩塩产物示便田A. AE l屮晾理.H n卜

24、LPlTtt产/-心人卜加更伙江!=I对选倉的克常进行材序分析图17-4徽卫川克降的分离及SSR标记产生示意图d W.UM标记U.然卫耶克隆的分离（五）其她标记1. CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence一taggedsites) CAPs技术又称为PCRRFLPo用特异设计的PCR引物扩增目 标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很小，以至无多态性 出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性 （Akopyanz等，1992）。其基本步骤就是:先利用特定引物进行PCR扩增， 然后将PCR扩增产物用限制性内切酶

25、酶切,酶切产物通过琼脂糖凝胶电 泳将DNA片段分开，澳化乙锭（EB）染色，观察其多态性。与RFLP技术一 PCRFifl驰电沐分析方医？ 聲丙慵脱际胶分析 庙分規那凝JK分折 变性聚丙烯洗技凝縊分析分子标记辅助选择育种样,CAPs技术检测的多态性其实就是酶切片段大小的差异。Talbert等 （1994）在小麦中将RFLP标记转化为STS标记过程中，有些STS标记无多 态，但酶切后又出现多态性。CAPs作为一种分子标记，有以下几个优点： 引物与限制酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会，而且操作简便， 可用琼脂糖电泳分析。在真核生物中,CAPs标记呈共显性。所需DNA 量少。结果稳定可靠。操作简便

26、、快捷、自动化程度高。CAPs标记 最成功的应用就是构建拟南芥遗传图谱。Konieczny等（1993）将RFLP 探针两端测序，合成PCR引物，在拟南芥基因组DNA中进行扩增,之后用 一系列4碱基识别序列的限制性内切酶酶切扩增产物，产生了很多CAPs 标记，并且只用了 28个巧植株，就将这些CAPs标记定位在各染色体上并 构建了遗传图谱。I-tittalmani （1995）等找到了一个抗稻瘟病基因 Pi-2（t）的CAPs标记。总之,CAPs标记在二倍体植物研究中可发挥巨大 的作用，就是PCR标记的有力补充。但在多倍体植物中的应用有一定局 性。另外,CAPs标记需使用内切酶，这又增加了研究

27、成本,限制了该技术 的广泛应用。2. STS （Sequence一tagged sites）STS 就是序列标签位点或序标位的简称。它就是指基因组中长度为200500bp,且核昔酸/顷 序已知的单拷贝序列,可釆用PCR技术将其专一扩增出来ol989年，华盛 顿大学的Olson等人利用STS单拷贝序列作为染色体特异的界标 (Landmark),即利用不同STS的排列顺序与它们之间的间隔距离构成 STS图谱，作为该物种的染色体框架图(Framework map),它对基因组研 究与新基因的克隆以及遗传图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。 STS引物的获得主要来自RFLP单拷贝的探针序列，微卫星序

28、列。其中， 最富信息与多态性的STS标记应该就是扩增含有微卫星重复顺序的DNA 区域所获得的STS标记。迄今为止,STS引物的设计主要依据单拷贝的RFLP探针，根据 已知RFLP探针两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增。与RFLP相 比,STS标记最大的优势在于不需要保存探针克隆等活体物质，只需从有 关数据库中调出其相关信息即可。最近，随着人类基因组研究的深入，表 分子标记辅助选择育种达序列标定(expressed sequence tags, ESTs)应运而生。由于它直接与 一个表达基因相关,很易于转变成STSoSTS标记表现共显性遗传，很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记 的转移，且

29、就是沟通植物遗传图谱与物理图谱的中介，它的实用价值很 具吸引力。但就是，与SSR标记一样,STS标记的开发依赖于序列分析及 引物合成，目前仍显成本太高。目前，国际上已开始收集STS信息，并建 立起相应的信息库，以便于各国同行随时调用。第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术MAS育种不仅可以通过与目标基因紧密连锁的分子标记在早世 代对目的性状进行选择，同时，也可以利用分子标记对轮回亲本的背景 进行选择。目标基因的标记筛选（gene taggmg）就是进行MAS育种的基 础。用于MAS育种的分子标记需具备3个条件:分子标记与目标基因 紧密连锁（最好lcM或更小，或共分离）；标记适用性强，重复性好

30、，而且 能经济简便地检测大量个体（当前以PCR为基础）；不同遗传背景选择 有效。遗传背景的MAS则需要有某一亲本基因型的分子标记研究基础。一、遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记通过建立分子遗传图谱，可同时对许多重要农艺性状基因进行 标记。许多农作物上已构建了以分子标记为基础的遗传图谱。这些图谱 在重要农艺性状基因的标记与定位、基因的图位克隆、比较作图以及MAS 分子标记辅助选择育种育种等方面都就是非常有意义的。但就是由于分子标记数目的限制，目 前作图亲本的选用首先考虑亲本间的多态性水平，育种目标性状考虑较 少，这样使遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记筛选割裂开来。 因此，根据育种目标选

31、用两个特殊栽培品种作为亲本来构建作物的品种 品种图谱,将作物图谱构建与寻找与农艺性状基因紧密连锁的分子 标记有机结合起来。遗传作图的原理与经典连锁测验一致，即基于染色体的交换与 重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合， 而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间 的交换而发生基因重组。用重组率来表示基因间的遗传距离，图距单位 用厘摩(centi一Morgan, cM)表示，一个cM的大小大致符合1 %的重组 率。遗传图谱只显示基因间在染色体上的相对位置，并不反映DNA的实 际长度。遗传图谱构建的主要环节为:根据遗传材料之间的多态性确 定亲本组合，建立作

32、图群体;群体中不同植株的标记基因型分析;借 助计算机程序构建连锁群。因此,要构建好的遗传图谱，首先应选择合适 的亲本及分离群体，这直接关系到建立遗传图谱的难易程度，遗传图谱 的准确性及所建图谱的适用性。亲木间的差异不宜过大，否则会降低后 代的结实率及所建图谱的准确度。而亲本间适度的差异范围因不同物种 而异，通常多态性高的异交作物可选择种内不同品种作杂交亲本，而多 态性低的自交作物则需选择不同种间或亚种间品种作杂交亲本。如玉米 分子标记辅助选择育种的多态性极好，一般品种间配制的群体就可成为理想的分子标记作图群 体,而番茄的多态性较差，因而选用不同种间的后代构建分子标记作图 群体。用于分子标记的遗

33、传作图群体一般分为两类，一类为暂时性分 离群体，包括F2群体、BC等；另一类为加倍单倍体(doubled hapOOd, DHL) 与重组近交系(recombinant Inbred Lines, RIL)等永久性分离群体。 自花授粉作物与异花授粉作物作图群体的构建方法如图17-5所示。分子标记辅助选择育种Fl* PiFiT14H1 ! K：!R2gDHL图 17-5C1花授粉作樹作悴的料世方法;R花体的怙住方銘：L . 4.、对H. ). G位点*说.相十于丹总八.C. 位点来说.郴当干髓交 ( (F位点不分寓遗传作用胖体构僮方法它们的特点见表172。兔群体构建比较省时。但由于每个巳单株 所

34、提供的DNA有限，且只能使用一代,限制了该群体的作图能力。BC群体 就是由珀与亲本之一回交产生的群体。由于该群体的配子类型较少，统 计及作图分析较为简单,但提供的信息量少于忌群体，且可供作图的材 料有限，不能多代使用。若通过远缘杂交构建的F：作图群体，易发生向两 极疯狂分离，标记比例易偏离3:1或1:2:1。第二类为永久性分离群体, 包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等。RIL群体就是由巳经多代自 交一粒传(Single seed descendant,简称SSD)使后代基大|组相对纯合的 群体。RIL群体一旦建立，就可以代代繁衍保存，有利于不同实验室的协 同研究，而且作图的准确度更高。缺点就

35、是建立RIL群体相当费时，而且 有的物种很难产生RIL群体。DH群体就是通过对F】进行花药离体培养 或通过特殊技术(如棉花的半配生殖材料)得到单倍体植株后代，再经染 色体加倍而获得的纯合二倍体分离群体。因此DH群体也能够长期保存。 但构建DH群体需深厚的组织培养基础与染色体加倍技术。与暂时性群 体相比，永久性群体至少有两方面长处:群体中各品系的遗传组成相 .M!仆AbCdefe分子标记辅助选择育种因系间的杂交分离群体进行标记与目的基因连锁的验证，从而筛选出与 目标基因连锁的分子标记oParam等1991年运用212个随机引物对萬苣 抗感霜霉病(Dm)的近等基因系进行了 RAPD分析，将4个RA

36、PD标记定位 在Dim与Dim连锁区域,6个定位在Dnrn连锁区。用近等基因系方法，还筛 选出燕麦锈病，大麦茎锈斑病，小麦的腥黑穗病,番茄的线虫、花叶病毒, 烟草的黑根瘤等抗性基因以及很多其她的目标基因的分子标记。三、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记近等基因系的基因作图效率很高,但一个近等基因系的培育耗 费时间长,既费工又费时，另外，许多植物很难建造其近等基因系，如一 些林木植物既无可利用的遗传图谱，又对其系谱了解很少，几乎不可能 创造近等基因系。1991年,Michelmore等提出了群体分离分析法 (Bulked segregant analysis, BSA),为快速、高效筛选重要

37、农艺性状 基因的分子标记打下了基础。下面以某一抗病基因为例说明构建BSA群 体的方法。用某一作物的抗病品种与感病品种杂交,F：抗病基因发生分 离。依抗病性表现将分离群体植株分为2组,1组为抗病的，另1组为感 病的。然后分别从两组中选出510株抗、感极端类型的植株提取DNA, 等量混合构成抗、感DNA池。对这两个混合DNA池进行多态性分析，筛 选出有多态性差异的标记,再分析巳所有的分离单株，以验证该标记与 目标性状基因的连锁关系以及连锁的紧密程度。NIL与BSA分析方法见 图 176o利用BSAMichelmore等（1991）从100个随机引物中筛选到分子标记辅助选择育种3个与萬苣Dm5 /

38、8基因连锁,且遗传距离在15cM内的分子标记。 Giovannoni等通过已知的RFLP遗传图谱，选择不同的RFLP基因型建立 DNA混合库，筛选出与西红柿果实成熟及茎蒂脱落基因连锁的RAPD标 记。目前，利用该法已广泛用于主要农作物重要农艺性状基因连锁的分 子标记筛选。四、数量性状基因的定位产量、成熟期、品质、抗旱性等大多数重要的农艺性状均表现 为数量性状的遗传特点。影响这类性状的表型差异由多个基因位点（数 量性状位点,QTL）与环境共同决定，子代常常发生超亲分离。筛选与多基 I大1控制的数量性状基因连锁的分子标记要比筛选主基因控制的质量性 状复杂得多。用于QTL分析的群体最好就是永久性群体

39、，如重组近交系与加 倍单倍体群体。永久性群体中各品系的遗传组成相对稳定，可通过种子繁殖代 代相传，并可对目标性状或易受环境因素影响的性状进行重复鉴定以得 到更为可靠的结果。从数量性状遗传分析的角度讲，永久性群体中各品 系基因纯合，排除了基因间的显性效应，不仅就是研究控制数量性状基 因的加性、上位性及连锁关系的理想材料，同时也可在多个环境与季节 中研究数量性状的基因型与环境互作关系。永久性群体培育费用高，因此QTL的标记与定位也有用暂时性 分子标记辅助选择育种分离群体。开始时，分离群体用单标记分析方法进行QTL的定位。例如, 在一个P2群体，给予任何一个特定的标记M,如果所有MiMl同质个体的

40、表型平均值高于M2M2同质个体，那么就可以推断存在一个QTL与这个标 记连锁。如果显著水平设置太低，这种方法的假阳性高。此外,QT1不一 定与任一给定的标记等位，尽管它与最近的标记之间具有很强的联系， 但它的准确位置与它的效应还不能确定。区间作图的引入，克服了上述许多问题。它沿着染色体对相邻标记区 间逐个进行扫描，确定每个区间任一特定位置的QTL的似然轮廓。更准 确地说，就是确定就是否存在一个QTL的似然比的对数(Lander & Bostien, 1989)。在似然轮廓图中，那些超过特定显著水平的最大值处， 表明就是存在QTL的可能位置。显著水平必须调整到避免来自多重测验 的假阳性，置信区间

41、为相对于顶峰两边各1个L0D值的距离。它一直就 是应用最广的一种方法，特别就是它应用于自交衍生的群体。其软件 Mapmaker / QTL(Whiteheadinstitute, 1993)就是免费提供的。尽管已 对该方法进行过许多精度与效率的研究,但都没有产生重要的修改。分子标记辅助选择育种(a)冃标星ftl位点b)IItfflll 1IIH第2种方法就是Haley & Knott (1992)发展的多元回归分析 法。该方法相对L0D作图而言，在精度与准确度上与区间作图产生非常 相似的结果，它具有程序简单、计算快速的优点，适合于处理复杂的后代 与模型中包含广泛的固定效应的情形。例如,性别的不

42、同与环境的不同。 显著性测验与置信区间估计可利用Bootstrapping抽样方法 (Visscher et al, 1996;Lebreton & Visscher,1998)o第3种方法就是同时用一个给定的染色体上的所有标记进行回归模 型分析，利用加权最小平方与法或者模拟进行显著性测验p p R9BC7F2(MIL)c)P.R) P： (S) NIUR) Bulk I(S) Bulk 2(R)标忙分析0N 17-6 NIL和BSA法分析G)近零基因系的创建(bH的分禽(c)近寺耳因歩和群体分纽分衍两忡方袪的分f活记分析 ( Pm2+Pni6+Pni：i、Pmla+Pm2i等小麦白粉病抗性基

43、因的聚合, 从而拓宽了现有育种材料对白粉病的抗谱，提高了抗性的持久性。利用 具有单个不同抗性基因的4个亲本，通过MAS三个世代即可获得同时具 有四个抗性基因的个体。国际水稻所Mackill利用MAS对水稻稻瘟病抗 性基因Pi1、pi-z5、pi-ta进行累集，获得了抗两种或三种小种的品 系。利用RAPD与RFLP标记,Yoshimura等已将水稻白叶枯抗性基因 Xa】、Xa3 Xa,.与X弧等基因进行了不同方式的聚合。在水稻中已将 含有抗白叶枯基因Xa:1的材料与抗虫基因材料杂交，利用Xa21的STS标 记获得了同时具有Xa2,与抗虫基因的材料旷通常应用MAS聚合不同基 因时,F：分离群体大小

44、应以200500株为宜，先对易操作的分子标记进 行初选，再进行复杂的RFLP验证，可提高聚合效率。分子标记辅助选择育种随着育种目标的多样性,为了选育出集高产、优质、抗病虫等优良性 状于一身的作物新品种,应考虑目标性状标记筛选时亲本选择的代表性, 即最好选择与育种直接有关的亲本材料，所构建群体也最好既就是遗传 研究群体，又就是育种群体，在此基础上，多个目标性状的聚合需通过群 体改良的方法实现。不容置疑,分子标记技术赋予了群体改良新的内涵， 借助于分子标记技术可快速获得集多个目标农艺性状于一身的作物新 品种。南京农业大学棉花研究所在多目标性状聚合的修饰回交方法育种的 基础上，提出了 MAS的修饰回

45、交聚合育种方法。修饰回交就是将杂种品 系间杂交与回交相结合的一种方法，即回交品系间的杂交法。将各具不 同优良性状的杂交组合分别与同一轮回亲本进行回交，获得各具特点的 回交品系，再把不同回交品系进行杂交聚合。目前利用分子标记技术可 对目标性状进行前景选择，对轮回亲木的遗传背景进行背景选择，就可 以达到快速打破目标性状间的负相关，获得聚合多个目标性状新品系的 目的（图178）o分子标记辅助选择育种AXDAXEIBC,A(B) XIA(BC标记辅助选择H标传甘妹A标记辆!W选择LI阪基因和遗传甘K:|标记辅助选於tr标基因和遗传角B： X BC,A(E)|标记鞘助遷择聚合也标基因A(DE)I标记糯肋

46、选择楽合目标直因A(BCDE)新品冲图17-8分子标记辅助迭择的修饰回交聚合育种示童出A:昵回来本 B. C. D、E;分初代衷各白育科目饭炷欢墓国的品系礎种负慣三、提高分子标记的筛选效率(一)多重PCR方法为了增加标记的筛选效率，当同时筛选到与2个或2个以上目 标性状连锁的几个不同的分子标记时，如果这几个分子标记的扩增产物 具有不同长度，则一对以上的引物可在同一PCR条件下同时反应,这称为 多重扩增。利用这种方法时需注意，设计或选择引物时，必须考虑各引物 复性温度就是否相匹配，且在扩增产物的大小上无重叠。研究表明，多重 扩增使用Taq酶量与一个引物扩增用量相同。这显著地降低了选择成本 费用与筛选时间。如Ribaut等将筛选到的与热带玉米抗旱基因QTL连 锁的1个STS, 2个SSR标记使用多重扩增方法用于MAS选择，以改良其 耐旱性，两人仅用了 一个月就从BCzFt的2300个单株中选出300个目标 单株。（二） 用相斥相分子标记进行育种选择AXBBC.XAAXCBC2XABC,A(C)FiX ABC, A(DFiX A分子标记辅助选择育种所谓相斥相分子标记指与目标性状相斥连锁的分子标记，即有 分子标记，植株不表现目标性状;无分子标记,植株表现目标性状。这些 选择特别在一些显性标记如RAPD标记中，效果