辣木籽油的提取及对小鼠佐剂性炎症的研究论文设计

1、1 概述1.1佐剂性炎症及危害性炎症是临床上常见的症状，机体活性组织遇到损伤因子时，机体主动发生防御的反应，属于机体应对损伤时的自我保护的一种表现。炎症是机体面对损伤时出现的最重要的自我捍卫的一种方式，但是对机体会产生危害，根据其人体的身体素质不同，危害也不同。炎症会引起机体发热、白细胞数目增加、厌食、腹泻、心律失常、血压升高、发抖等全身像反应，肿、痛、红、热是临床上最常见的局部表现。炎症的病理过程有三种，存在于血管中、局部组织中还有细胞中，有血管反应、局部组织损伤、细胞增生。临床上有两种炎症类型，一是慢性炎症，第二种是急性炎症，根据其作用时间决定的。急性炎症的发生大多是致炎因子在机体内存在，

2、并且它对机体的刺激所引起的，当体内得到信号会促使使机体立即发生早期的反应，目前临床上以渗出病变为其特征，其发作快速，维持大约几天、一个星期或一个月，时间较短。急性炎症发生时，机体血管内产生的白细胞和抗体等，它们通过血管壁进入机体发生炎症的部位，与病原体结合，杀灭病原体，最后体内毒素被稀释，然后再进一步中和，其作用机制给修复炎症提供较好的环境条件。致炎因子在机体内长期存在是慢性炎症发生的主要原因，细胞内是慢性炎症感染的地方，致炎因子长期存在会导致慢性炎症发生，同时会损伤组织。各种器官的慢性炎症可以因其他方式的发生所导致，还可以从急性炎症转化而来。目前存在很多原因与慢性炎症的形成有关，相关研究显示

3、，急性炎症老是反复发作，急性炎症也可能转化成慢性炎症的趋势，有的机体未出现相关明显炎症症状，还有一些其他方式，都可能是形成慢性炎症的发生的原因。慢性炎症治疗麻烦，耗时较长，需要较长时间，几月或几年都有可能，增生病变使其主要特征。类风湿性关节炎（RA）是一种在自身免疫性疾病范畴的慢性炎症。在手掌关节、膝关节、腕关节等地方发生，早期有疼痛、肿胀、晨起关节僵硬、身体疲倦、消瘦等全身反应。晚期有关节强直、畸形以及关节功能损伤，继而可能影响心、肺、肾等多脏器损伤，对患者的身心健康和生活质量带来严重危害1。古书上早已记载RA，自身正气不足和外感风邪湿热是其主要原因，中医上认为治疗RA应“祛邪活络,缓急止痛

4、”2。患RA的时间越长，导致残疾的可能性越高。并且RA可带来其他并发疾病，这使得RA患者比一般疾病患者的病死率高3。RA的高致残率和高病死率给患者带来了巨大的心理压力和生活负担。目前RA的治疗药物有很多，临床上主要使用非甾体抗炎药、抗风湿药及糖皮质激素这三种药物4。以上药物价格昂贵，药物不良反应众多，长期服药会带来其他副作用，危害患者身心健康。1.2 辣木籽油的研究现状辣木，印度大量种植，我国云南地区种植的辣木均是从印度引进而来，属于热带地区植物5。辣木中含有大量油脂，被称为多功能植物，人们初识它时因其根有辣味，故称其辣木。研究表明，辣木自身具有大量的营养成分，氨基酸、矿物元素、纤维、蛋白质、

5、油类、黄酮、多糖、维生素、甾醇、生物碱等大量存在6。查看了有关古罗马时期的书籍，发现关于辣木的记载颇多，食用药用都有，古书上说辣木的花、叶、根、种子都有药食同源的功效。查阅大量相关文献，辣木籽中含有丰富的人体所必须的氨基酸，有人体不能合成的氨基酸，也有人体可以合成但是需要的量赶不上合成的量的氨基酸，还有一些重要的药用活性，具有治疗失眠、增强体质、调节血压、控制血糖、缓解贫血、抑制病菌、预防肿瘤、治疗紫外线损伤等功效7。查阅辣木籽油提取工艺的相关文献，最终比较得出索氏提取法是较好的方法，操作步骤简单、快速，使用少量试剂就可以提取大量有效成分，缺点是只能少量操作，不适合大生产8。辣木具有消炎功效，

6、 一些炎症疾病使用辣木来治疗，有很好的帮助。国外对辣木籽的研究较多，在其药用价值、营养价值等做出较多研究。国内相关研究不多，在辣木籽的提取工艺优化方面有较多成果，在食用安全性毒理学有具体研究，抗紫外线方面也有相关研究，但目前辣木籽的药理研究较少。近年来，辣木籽越来越被大众所认识，它具有的防病治病功效得到广大消费者认可，慢慢被保健品行业列入9。在查阅大量辣木籽的相关文献之后，发现目前还没有人对其抗炎进行研究，因此通过探究其抗炎作用将对日后新药物的研发有较大帮助10。由于辣木籽在我国云南等地分布比较广泛，价格低廉容易获得，利用辣木籽油治疗炎症对普通的老百姓来说价格容易接受，探究其抗炎作用，对炎症的

7、治疗具有一定的意义，具有切实的可行性。2 实验材料与仪器2.1 实验动物小鼠：昆明种小鼠普通级，雌雄各半，购于安徽中医院大学小鼠饲养处，体重1822g。小鼠分笼饲养，室温条件，及时补充食物和饮水以供小鼠主动进食饮水，注意保持鼠笼和水瓶干净，经常清洗，经常更换垫料，保持干净等。2.2 实验药物与试剂辣木籽：市售一级，购于云南辣木生物科技有限公司； 石油醚：分析纯，购于益瑞化学试剂有限公司；布洛芬：购于湖北金龙福药业有限公司；蒸馏水；弗氏完全佐剂：购于褚瑞生物科技有限公司；吐温80：分析纯，购于利恒化学试剂有限公司（辣木籽油使用前，按照高中低组的剂量适当加入吐温80和蒸馏水，在研钵中研磨成乳剂，灌

8、胃使用）2.3 实验仪器粉碎机：湖北仁益仪器仪表有限公司、旋转蒸发仪：RE-3000，北京瑞成伟业仪器设备有限公司、足趾容量测量仪:pv-200,成都康泰科技有限公司、试剂盒：北纳生物科技有限公司、酶标分析仪：北京洪亚新技术有限公司、血液分析仪：南京贝登医疗股份有限公司。3 实验方法及测量指标3.1 辣木籽油的提取将辣木籽剥壳放入打粉机中打成粉末，称量20g的辣木籽仁粉，放置于过滤纸中进行封口包好，将其放球形冷凝管中，再添加进200 mL的石油醚，用铁架台固定装置，接通冷凝管，通入冷凝水，进行加热回流提取操作3 h，把提取到的提取液进行减压旋蒸除去其中的石油醚，最终得到辣木籽油成品，放入冰箱低

9、温冷藏，为抗炎实验储存备用11。图3.1 索氏提取辣木籽油流程图3.2 辣木籽油对小鼠佐剂性炎症的抗炎作用3.2.1 分组给药及佐剂性炎症模型的制作把48只雄性实验小鼠, 随机地分为6组, 标为正常组、模型对照组、辣木籽油高剂量组（6g/100ml）、辣木籽油中剂量组（4 g/100ml）、辣木籽油低剂量组（2 g/100ml）、阳性药(布洛芬 2 g/100ml)对照组, 每组分为8只。 除去当中的正常组，其余的6组分别用弗氏完全佐剂进行注射，用量为0.1ml，在小鼠的右脚后足跖皮下注射，从而致炎。正常组则在同一个部位注射等体积的生理盐水。 当致炎 1 h后对小鼠进行灌胃（20ml/kg），

10、每天一次， 接连四天, 其中正常组小鼠用相同容积的蒸馏水灌胃处理，模型组小鼠也用相同容积蒸馏水灌胃处理。3.2.2 测量指标3.2.2.1小鼠足趾肿胀程度的测定测定操作前，用记号笔在小鼠后足踝处化一个圈作为标记，各个小组分别用足趾肿胀仪测定这时每只小鼠的足趾容积。 在致炎1小时、 24 小时、 48 小时、72小时，各个小组分别用足趾肿胀仪测定这时每只小鼠的足趾容积, 然后用公式计算，得出肿胀度。 肿胀度(%)=(致炎后足趾容积值-致炎前足趾容积值)/致炎前足趾容积值100%3.2.2.2 小鼠血清NO的测定分组及给药同佐剂性炎症模型的制作。最后一次给药结束1 h之后, 对小鼠进行摘眼球取血后

11、，取血试管放入水浴锅中，在水温37下进行水浴加热, 再用转速为3500 r/min的离心机进行操作 10 min，分离其血清成分，而后按照试剂盒上的说明书步中的步骤进行依次操作, 放置与酶标仪当中，与550 nm的波长下进行测定其吸光度 A, 最后再按说明书上的计算公式进行计算实验小鼠的血清 NO的含量。3.2.2.3 小鼠血清白细胞数目的测定分组及给药同佐剂性炎症模型的制作。最后一次给药结束0.5h之后，各组小鼠分别进行摘眼球取血操作，采集血量，其中约一半的血液用于测定小鼠白细胞数目，在血液分析仪上分析小鼠白细胞数目。3.2.2.4 小鼠血清炎症因子数目的测定分组及给药同佐剂性炎症模型的制作

12、。各组小鼠分别进行断头取血操作，以肝素抗凝，3000r每分钟离心10分钟，取上层清液。用小鼠elisa试剂盒检测IL-1、IL-6及肿瘤坏死因子TNF-的分泌水平，操作步骤按照试剂盒说明来进行。3.2.3 统计学分析本实验的数据统计分析采用SPSS 19.0版软件,以均数标准差( xs)表示计量资料,采用单因素方差分析和 LSD-t 检验比较各组间差异,以 P0.05为差异有统计学意义。4 实验结果4.1 辣木籽油对小鼠足肿胀度的影响表4-1 辣木籽油对小鼠足趾肿胀度的影响(XS,n=8)组别给药浓度（gml-1d-1） 不同时间小鼠足趾肿胀程度 1h 24h 48h 72h空白对照组3.15

13、.83.24.13.35.03.11.6模型组65.513.8* 51.623.8*32.816.5*21.415.8*阳性药对照组（2g/100ml)0.0818.613.79.17.64.95.63.14.3辣木籽油低剂量组（2g/100ml)0.0826.710.229.712.224.213.67.68.6辣木籽油中剂量组（4g/100ml)0.1639.415.027.219.918.713.95.52.4辣木籽油高剂量组（6g/100ml)0.2419.212.0*16.914.7*10.59.3* *3.36.2* * 注：与空白对照组比较* p0.05，*p0.01 从表4-1

14、分析数据可以看出，测量辣木籽油对实验小鼠足趾肿胀度的影响程度，将模型组实验小鼠的肿胀度与准备好的空白对照组的小鼠进行比较，结果显示，模型组小鼠肿胀度很高，相比较而言差异显著，而通过灌胃高剂量的辣木籽油的实验组与模型组相比较显示，辣籽油高剂量组的小鼠足趾肿胀度显著低于与模型组。剩下两组辣木籽油组小鼠足趾肿胀度也低，都低于模型组。分析以上实验数据，辣木籽油高剂量组与其他给药组相比，高剂量组的肿胀程度更低。4.2 辣木籽油对小鼠血清NO的影响表4-2 辣木籽油对小鼠血清NO的影响（XS,n=8）组别给药浓度（gml-1d-1）血清中NO含量C/mol ml-1 正常组29.7922.14模型对照组

15、88.1927.25*阳性药对照组（2g/100ml)0.0860.3520.32*辣木籽油低剂量组（2g/100ml)0.0862.1732.02*辣木籽油中剂量组（4g/100ml)0.1655.6329.19*辣木籽油高剂量组（6g/100ml)0.2448.1322.35* *注：与空白对照组比较* p0.05，*p0.01从表4-2数据可以看出，辣木籽油对血清中NO含量的影响，模型对照组与正常组数据进行比较，模型对照组小鼠血清NO含量很高，其数值与正常组的有很大差距。辣木籽油组与模型组的数据进行比较，辣木籽油组血清中NO含量很低，而且辣木籽油（高剂量组）与比其他用药组的数据比较，高剂

16、量组小鼠血清中NO含量更低。4.3 辣木籽油对小鼠血清白细胞数目的影响表4-3 辣木籽油对小鼠白细胞数目的影响（XS,n=8）组别给药浓度（gml-1d-1）小鼠白细胞数目/L正常组6.351.26模型对照组18.472.27* *阳性药对照组（2g/100ml)0.087.561.48* 辣木籽油低剂量组（2g/100ml)0.0813.241.57* *辣木籽油中剂量组（4g/100ml)0.1611.412.68* 辣木籽油高剂量组（6g/100ml)0.248.321.47* 注：与空白对照组比较* p0.05，*p0.01从表4-3数据可以看出，辣木籽油对小鼠白细胞数目的影响，模型组

17、小鼠与空白对照组的实验数据相比较，模型组小鼠的白细胞数目显著增加。与模型组相比较，辣木籽油组白细胞数目明显降低，而且辣木籽油（高剂量组）的白细胞数目比其他用药组更低。4.4 辣木籽油对小鼠血清炎症因子数目的影响表4-4 辣木籽油对小鼠血液中炎性因子数目的影响（XS,n=8）组别给药浓度（gkg-1d-1）TNF-aIL-6IL-1空白对照组0.541.2836.111.311.42.56模型组1.931.65* *44.812.7* 19.0711.89* 阳性药对照组（2g/100ml)0.080.471.65* *38.716.7* * 12.565.09* 辣木籽油低剂量组（2g/100

18、ml)0.080.811.24* 49.425.1* 17.3414.23* 辣木籽油中剂量组（4g/100ml)0.160.701.32* 45.213.8* 13.719.28* 辣木籽油高剂量组（6g/100ml)0.240.551.36* *38.623.5* *11.688.91* *注：与空白对照组比较* p0.05，*p0.01从表4-4可以看出，辣木籽油对小鼠血液中炎性因子数目的影响，模型组与空白对照组的实验数据相比较，模型组的小鼠血液中的炎性细胞因子IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子TNF-a分泌的数目较多。与模型组相比较，辣木籽油组炎性细胞因子IL-1、IL-6、TNF-a分

19、泌的数目较少，而且辣木籽油高剂量组炎性细胞因子的分泌数目更少。5 实验结论研究表明, 佐剂性炎症的发生均与肿胀度、血清NO、白细胞数目以及炎症因子有关，炎症会导致血清NO含量升高，白细胞数目增多，炎症因子含量增加。从实验数据分析的结果上看，辣木籽油低中高剂量组与模型组的所有实验数据进行比较，足肿胀容积明显降低、小鼠血清NO含量显著降低、小鼠血液中的炎性细胞因子IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子TNF-a分泌的数目明显下降。本实验采用佐剂性炎症模型是研究RA及确证抗炎免疫药物的理想动物模型，其所得数据具有一定的说服力。因此辣木籽油对佐剂性炎症具有一定的抗炎作用，在佐剂性炎症治疗方面有一定的积极作用。6 讨论本实验采用了索氏提取辣木籽油，使用了佐剂型炎症模型测定小鼠足趾肿胀度、小鼠血清NO含量、小鼠白细胞数目及炎症因