脓汁和粪便标本中病原菌的检测-2

1、器材准备器材准备浓汁标本浓汁标本1 1支，粪便标本支，粪便标本1 1支；碘酒棉球支；碘酒棉球1 1瓶，酒精棉球瓶，酒精棉球1 1瓶，眼科镊子瓶，眼科镊子2 2把；伊红美兰平板把；伊红美兰平板2 2个，营养琼脂平板个，营养琼脂平板5 5个。个。自然界中的微生物v已经发现的微生物超过13万5千种，被认为非常危险的有600种，在人间传染的病原微生物380种。它们存在于地球的各个角落，从寒冷的极地到炎热的赤道，从4.2千米地层深处到85千米高空（芽孢）,均有它们的踪迹 。v空气、水、土壤、人体的体表以及与外界相通的腔道，均有不同种类和数量的微生物存在。v存在于人体消化道的细菌细菌超过800种，数量可达

2、100万亿（1014），菌体重量11.5公斤。医学微生物学实验综合性实验三 P38 Comprehensive Experiment 3 v空气与人体体表细菌学检查空气的细菌学检查P38手指皮肤的细菌学检查P41空气的细菌学检查 空气空气是人类赖以生存的环境之一，也是重要的疾病传播媒介。空气中的病原菌主要来自病人的排泄物和分泌物。这些污物，因风吹，以及人类日常活动，以气溶胶气溶胶的形式悬浮于空中，使空气受到污染。v环境：不利于微生物生长。v种类：主要是病毒、真菌和细菌。在医院，公共场所致病菌的数量比较多。v作用：可迅速全球传播。v危害：引起培养基、生物制品的污染，病原菌引起呼吸道传染病。v实验

3、方法(自然沉降法):根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位（ colony forming unit ，CFU），了解空气的污染情况。v实验步骤：每组1个营养琼脂平板，选择采样地点（实验室、卫生间或任选地点），将平板盖打开，盖朝下放将平板盖打开，盖朝下放置在平板旁边，平板暴露于空气中置在平板旁边，平板暴露于空气中1515分钟，分钟，然后盖上盖子，作标记。37温箱培养24小时，观察结果。 CFU/m3 50000NAT86N(直径7cm平板）。 N：平板上的菌落数。 A：平板面积(平方厘米)。 T：采样时间(分钟)。平 板 盖打

4、 开 ，盖 朝 下放 在 平板 旁 ，琼 脂 平板 暴 露15分钟。空气的细菌学检查空气的细菌学检查 暴露法（暴露法（Exposure Method)Exposure Method)组号采样地点采样时间(min)菌落形成单位(CFU)1实验室152卫生间153门诊大厅154呼吸科走廊155呼吸科病房156呼吸科ICU157外科走廊158外科病房159外科ICU1510外科治疗室15手指皮肤的细菌学检查P41v在日常生活中，手的接触范围广，使用频率高，受到污染的机会也最多。一只外观比较“干净 ”的手，可携带10万个细菌、200多种病毒。因此，经手传播的疾病很多，范围很广，包括肠道传染病、部分呼吸

5、道传染病、皮肤传染病，以及一切可经手传播的疾病。v常住菌：常住菌：存在于皮肤表面、毛囊和皮脂腺。种类和数量比较恒定。附着在皮肤上比较牢固，用一般洗手方法，常不易去除。v暂住菌：暂住菌：存在于皮肤表面经常暴露的部位。暂住菌是外来的非正常菌群，种类和数量不定。引起人类致病的通常是暂住菌。v医务人员，经常与病人接触，可传播病菌。虽然病菌的直接来源是患者, 但是造成病菌扩散的主要途径则是气溶胶和医务人员的手。v经常洗手和消毒是控制医院内交叉感染的主要方法。v预防感染措施中，最简单又十分有效的方法就是洗手。据测定，只用自来水洗手可使暂住菌暂住菌总数减少40%，用肥皂洗手可减少80%以上。v洗手？常规的洗

6、手方法常规的洗手方法（甲和丙操作）v将手充分浸湿，涂抹肥皂或洗涤液。v反复搓揉双手，搓揉时间不应少于 30秒。v用流水冲洗干净，整个洗手过程不少于1分钟。能有效地去除大多数手上的暂住菌。医学微生物学教学实验室标准洗手方法标准洗手方法（乙和丁操作）v用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。用流动的水冲洗，将手充分浸湿，涂抹肥皂、洗涤液。v分别搓擦分别搓擦10101515次。次。v保持双手低于肘部，保持双手低于肘部，流水冲洗一分钟以上。流水冲洗一分钟以上。1.1.掌心对掌心搓擦掌心对掌心搓擦 2.2.手指交错掌心对手背搓擦手指交错掌心对手背搓擦 3.3.手指交错掌心对掌心搓擦手指交错掌心对

7、掌心搓擦4.4.两手互握互搓指背两手互握互搓指背 5.5.拇指在掌中转动搓擦拇指在掌中转动搓擦 6.6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦1.掌心对掌心搓擦掌心对掌心搓擦 2.手指交错掌心对手背搓擦手指交错掌心对手背搓擦 3.手指交错掌心对掌心搓擦手指交错掌心对掌心搓擦4.两手互握互搓指背两手互握互搓指背 5.拇指在掌中转动搓擦拇指在掌中转动搓擦 6.指尖在掌心中搓擦指尖在掌心中搓擦1 3 2 4 1 3 2 4 手指皮肤的细菌学检查甲和乙、丙和丁共用1个平板上:甲、丙常规洗手下:乙、丁标准洗手甲（丙）乙（丁）丙丁第1格为洗手前，第2格为洗手后，第3格为消毒后，第4格空白对照。 在培养基表面触摸

8、触摸23厘米医学微生物学实验综合性实验一(P2)v脓汁和粪便标本中病原菌的检测(二） 细菌的分离与培养P7目的要求：掌握分离、纯化微生物的基本操作技术。平板划线分离法平板划线分离法 Streak Plate MethodStreak Plate Methodv借助于划线，将混杂的多种多种细菌，在平板表面分散成单个细菌，并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖，形成肉眼可见的细菌集团（单菌落）。Colony：在固体培养基表面或基内，由单个单个细菌在局部位置不断增值，形成肉眼可见的细菌集团，称为单菌落。Colony Forming Units:由单个或聚集成团的多个菌体，在固体培养基上生长繁殖，

9、形成一个肉眼可见的细菌集落，称为菌落形成单位。Lawn:在固体培养基表面，由许多菌落融合在一起形成一片密集的的细菌群落,称为菌苔。平板分区划线分离方法步骤（平板分区划线分离方法步骤（5 5区）区）v接种环烧灼灭菌，以免污染标本。v取标本在平板表面上方密集涂布510mm2。v烧掉接种环上多余的标本（火焰背面烤干烧灼）。v晃动平板，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。v接种环与平板呈3040度角，通过密集涂布部分3次，使接种环重新沾上少量标本(细菌)，然后在平板表面，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于3

10、0条。v转动平板，接种环通过第一区1次，同样的 方法划第二区。如此依次划完35区。v接种环烧灼灭菌，以免污染环境。v将平板倒置37培养1824h,观察结果 。充分利用平板面积，不能划破琼脂。充分利用平板面积，不能划破琼脂。第四区第一区正确正确correctcorrect错误错误incorrectincorrect每区划线不少于30条，整个平板划线不少于150条线。37培养24小时 37培养24小时 小组分工v甲脓汁标本营养琼脂平板(nutrient agar plate)v乙脓汁标本营养琼脂平板(nutrient agar plate）v丙粪便标本伊红美蓝平板(eosin methylene

11、blue plate）v丁粪便标本伊红美蓝平板(EMB plate）甲 乙 4丙 丁甲 乙 3丙 丁甲 乙 2丙 丁甲 乙 1丙 丁甲 乙 5丙 丁甲 乙 8丙 丁甲 乙 7丙 丁甲 乙 6丙 丁甲 乙 10丙 丁甲 乙 9丙 丁 讲 台左右杆1214cm环直径24mm柄10cm接种环接种环 inoculatinginoculating looploop杆1214cm柄10cm针长46cm接种针接种针 straight wirestraight wire inoculating inoculating wirewire ,inoculating needleinoculating needle

12、接种环烧灼灭菌 Flame Loopv使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和金属丝烧红即可烧红即可，接种环35秒钟冷却 。v使用后，先在火焰背面将把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。v金属杆快速通过火焰23次，杀灭表面微生物。酒精灯无菌操作区外焰外焰:又称氧化焰又称氧化焰,火焰火焰呈淡紫色呈淡紫色,温度较高。温度较高。无菌操作区无菌操作区: :火焰周火焰周围围101020cm20cm范围内。范围内。环面水平水平离开液面：快速6ul,慢速2ul。环面垂直垂直离开液面：快速3ul,慢速1ul。接种环取液体标本的方法接种环取液体标本的方法环直径环直径3mm3mm无菌取材基本

13、步骤无菌取材基本步骤 在火焰旁边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞上端，缓慢拔出棉塞并夹持之夹持之（棉塞下端不得接触到管口外任何物体）管口迅速通过火焰3次取标本取标本管口通过火焰三次，塞棉塞。接种环、平板的握持方法接种环、平板的握持方法生物安全警告v接种环接种平板一次，可产生几十个微生物气溶胶颗粒。v气溶胶粒径100um沉降很快，50um在0.4s内扩散开，5um通过呼吸道直接到达肺泡。vPike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。v实验时应坐着，在火焰周围1020厘米内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。

14、三级生物安全防护思考题v为何取链球菌作为空气的卫生指标之一?v为什么金黄色葡萄球菌是医院内感染常见的重要病原菌?v为什么接种环使用前后必须烧灼灭菌？忽略了有什么危害?v做细菌培养时，平板为什么要倒置?v培养细菌的常用方法有哪些?v从临床标本中分离病原菌，应注意哪些事项? 实验内容v空气的细菌学检查P38营养琼脂平板(黄色,1组1个）v手指皮肤的细菌学检查P41营养琼脂平板(黄色,2人1个 划分8格）v平板划线分离法P8 甲脓汁标本营养琼脂平板(黄色）乙脓汁标本营养琼脂平板(黄色）丙粪便标本伊红美蓝平板(紫色）丁粪便标本伊红美蓝平板(紫色）常用器材摆放顺序：电源插座常用器材摆放顺序：电源插座试管架试管架酒精灯酒精灯污物盘。污物盘。试管架上器材：靠近插座一侧第试管架上器材：靠近插座一侧第