实验四肌肉组织氨基移换作用纸层析精选文档

1、一、实验目的一、实验目的1. 了解氨基移换作用的原理。了解氨基移换作用的原理。2. 熟悉纸层析法的基本原理。熟悉纸层析法的基本原理。3. 掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的方法。掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的方法。n 氨基移换作用（转氨基作用）氨基移换作用（转氨基作用）在在转氨酶转氨酶的作用下，某一氨基酸去掉的作用下，某一氨基酸去掉-氨基生成相氨基生成相应的应的- -酮酸，而另一种酮酸，而另一种-酮酸得到此氨基生成相应的氨基酮酸得到此氨基生成相应的氨基酸的过程。酸的过程。二、实验原理二、实验原理n 人体内最重要的两种转氨酶：人体内最重要的两种转氨酶：谷丙转氨酶（谷丙转氨酶（gpt）/丙氨酸转氨酶（丙氨

2、酸转氨酶（alt） 谷草转氨酶（谷草转氨酶（got）/天冬氨酸转氨酶（天冬氨酸转氨酶（ast）谷氨酸谷氨酸 +丙酮酸丙酮酸-酮戊二酸酮戊二酸 +丙氨酸丙氨酸gpt谷氨酸谷氨酸 +草酰乙酸草酰乙酸 -酮戊二酸酮戊二酸 +天冬氨酸天冬氨酸 got正常人各组织中正常人各组织中gpt及及got 活性活性 (单位单位/克湿组织克湿组织)n血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预后的指标之一。后的指标之一。组组 织织 gpt got组组 织织 gpt got 肝肝 44000 142000胰胰 腺腺 2000 28000 肾肾 19000 91000脾脾 1200

3、14000 心心 7100 156000肺肺 700 10000 骨骼肌骨骼肌 4800 99000血清血清 16 20cooh cooh ch2ch2c=ohcnh2coohch3coohcoohch2ch2chnh2coohch3c=o alt谷氨酸谷氨酸 丙酮酸丙酮酸-酮戊二酸酮戊二酸 丙氨酸丙氨酸2. 层析层析 层析系统通常都有两个相组成：层析系统通常都有两个相组成：固定相固定相和和流动相。流动相。混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用在这两相中的分配情况，一般用分配系数分配系数来描述。来描述。常用的分配层析

4、包括柱层析、纸层析、薄层层析。常用的分配层析包括柱层析、纸层析、薄层层析。纸层析法纸层析法固定相：吸附在滤纸纤维之间的水分固定相：吸附在滤纸纤维之间的水分流动相：层析液水饱和酚流动相：层析液水饱和酚分离原理分离原理：利用混合物各组分在固定相和流动相中分配系数利用混合物各组分在固定相和流动相中分配系数差异而分离差异而分离谷氨酸：亲水性氨基酸谷氨酸：亲水性氨基酸丙氨酸：疏水性氨基酸丙氨酸：疏水性氨基酸3. 显色反应显色反应茚三酮与茚三酮与- -氨基酸反应生成紫红色化合物氨基酸反应生成紫红色化合物相对迁移率相对迁移率rf三、实验步骤三、实验步骤1、酶液的制备酶液的制备2、氨基移换反应氨基移换反应 加

5、入物（加入物（ml）对照管对照管测定管测定管 肌匀浆肌匀浆10滴滴10滴滴煮沸煮沸 5 min37 5 min0.1 mol/l丙氨酸溶液丙氨酸溶液0.5 ml0.5 ml0.1 mol/l-酮戊二酸溶液酮戊二酸溶液0.5 ml0.5 ml0.01 mol/l 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液1.5 ml1.5 ml混匀，混匀， 37 50 min 煮沸煮沸5 min3 3、层析、层析圆滤纸上标记圆滤纸上标记点样点样制作滤纸芯制作滤纸芯滤纸芯插入圆滤纸滤纸芯插入圆滤纸组装层析装置组装层析装置4 4、显色、显色把层析后的滤纸取下，吹风机吹干后，用喷雾器把层析后的滤纸取下，吹风机吹干后，用喷雾器均匀喷洒均匀喷洒0.50.5茚三酮溶液，再用吹风机吹干。茚三酮溶液，再用吹风机吹干。四