大肠杆菌感受态细胞的制备和转化ppt课件

1、分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 在自然条件下在自然条件下, ,很多质粒都可经过细菌接协作用转移很多质粒都可经过细菌接协作用转移到新的宿主内到新的宿主内, ,但在人工构建的质粒载体中但在人工构建的质粒载体中, ,普通缺乏此种普通缺乏此种转移所必需的转移所必需的mobmob基因基因, ,因此不能自行完成从一个细胞到另因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌受体细胞经理化方法处置后，需将对数生长期的细菌受体细胞经理化方法处置后，细胞膜的通透性发生暂时性改动，成为

2、能允许外源细胞膜的通透性发生暂时性改动，成为能允许外源 DNA DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。分子进入的细胞，称感受态细胞。一一. . 实验原理实验原理1. 概念概念感感 受受 态态 细细 胞胞分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 转化转化(Transformation)是将外源是将外源DNA分子引分子引入受体细胞入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段使之获得新的遗传性状的一种手段,它它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研讨领域是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研讨领域的根本实验技术。的根本实验技术。 转转 化化分分子子生生物物学学2008实实验验2 20

3、01 10 0 转化过程所用的受体细胞普通是限制修饰系统缺陷的变异转化过程所用的受体细胞普通是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体,它可以容忍它可以容忍外源外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。分子进入体内并稳定地遗传给后代。 受体细胞经过一些特殊方法受体细胞经过一些特殊方法(如物理制备法如物理制备法,化学制备法等化学制备法等)的处置后的处置后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改动细胞膜的通透性发生了暂时性的改动,成为能允许成为能允许外源外源DNA分子进入的感受态细胞分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 进入

4、受体细胞的进入受体细胞的DNA分子经过复制分子经过复制,表达实现遗传信息的表达实现遗传信息的转移转移,使受体细胞出现新的遗传性状。使受体细胞出现新的遗传性状。 将经过转化后的细胞在挑选培育基中培育，即可挑选出转将经过转化后的细胞在挑选培育基中培育，即可挑选出转化子化子(Transformant,即带有异源即带有异源DNA分子的受体细胞分子的受体细胞)。 转转 化化转化过程转化过程分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0KCl法，法， CaCl2法，电击感受态制备等法，电击感受态制备等 RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，法制备的感受态细胞转化效率较高，但制备较

5、复杂，不适宜实验室用但制备较复杂，不适宜实验室用 电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电电击感受态细胞转化效率高，操作简便，但需电击仪击仪 CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足法简便易行，且其转化效率完全可以满足普通实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用普通实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可参与占总体积时，可参与占总体积15的无菌甘油于的无菌甘油于-70以下以下保管半年，因此保管半年，因此CaCl2法运用更为广泛法运用更为广泛.常用的感受态细胞制备方法常用的感受态细胞制备方法分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 CaCl2法是以法是以Mendel

6、和和Higa1970的发现，其的发现，其根本原理是：细胞处于根本原理是：细胞处于 0 4 ， CaCl2 低渗溶液低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 构成抗构成抗 DNA 酶的羟基酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于钙磷酸复合物粘附于细胞外表，经细胞外表，经 42 90 秒热激处置，促进细胞吸收秒热激处置，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培育基中保温混合物。将细菌放置在非选择性培育基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培

7、育物卡那霉素耐药基因得到表达，然后将此细菌培育物涂在含卡那霉素的选择性培育基上，倒置培育过夜，涂在含卡那霉素的选择性培育基上，倒置培育过夜，即可获得细菌菌落。即可获得细菌菌落。 CaCl 2 法制备感受态细胞原理法制备感受态细胞原理分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0提高转化效率的几个要素提高转化效率的几个要素 细胞生长形状和密度细胞生长形状和密度 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度 试剂的质量试剂的质量 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染的污染分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 细胞生长形状和密度细胞生长形状和密度: : 不要用经过多次转接或

8、储于不要用经过多次转接或储于的培育菌，最好从的培育菌，最好从7070或或-20-20甘油保管的菌种中直接转接用于制备甘油保管的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可经过监测培育液的长期时为好，可经过监测培育液的OD600 OD600 来控制。来控制。DH5DH5菌株的菌株的OD600 OD600 为为0.50.5时时, ,细胞密度在细胞密度在5 5107 107 个个/ml/ml左右左右( (不同的菌株情况有所不同不同的菌株情况有所不同),),这时比较适宜。这时比较适宜。密度过高或缺乏均会影响转化效率。密度过

9、高或缺乏均会影响转化效率。 提高转化效率的几个要素提高转化效率的几个要素分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度: 用 于 转 化 的 质 粒用 于 转 化 的 质 粒 D N A 主 要 是 超 螺 旋 态主 要 是 超 螺 旋 态DNA(cccDNA)。转化效率与外源。转化效率与外源DNA的浓度在一定的浓度在一定范围内成正比范围内成正比,但当参与的外源但当参与的外源DNA的量过多或体积的量过多或体积过大时过大时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。1ng的的cccDNA即可使即可使50l 的感受态细胞到达饱和。普通情况下的感受态细胞到达

10、饱和。普通情况下,DNA溶液溶液的体积不应超越感受态细胞体积的的体积不应超越感受态细胞体积的5。提高转化效率的几个要素提高转化效率的几个要素分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 试剂的质量试剂的质量: 所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 等均需是最高纯度的等均需是最高纯度的,并用超并用超纯水配制纯水配制,最好分装保管于枯燥的冷暗处最好分装保管于枯燥的冷暗处 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进展整个操作过程均应在无菌条件下进展, 所用器皿所用器皿, 如离心管如离心管, tip头等最好是新的头等最好是新的,并经高压灭菌处置并经高压

11、灭菌处置,一一切的试剂都要灭菌切的试剂都要灭菌,且留意防止被其它试剂、且留意防止被其它试剂、DNA酶酶或杂或杂DNA所污染所污染, 否那么均会影响转化效率或杂否那么均会影响转化效率或杂DNA的转入的转入, 为以后的挑选、鉴定带来不用要的费为以后的挑选、鉴定带来不用要的费事。事。 提高转化效率的几个要素提高转化效率的几个要素分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 01资料资料E. coli DH5菌株；菌株； 质粒、质粒、 1.5ml 离心管又称离心管又称eppendorf管管 卡那霉素；卡那霉素； 2设备设备 恒温摇床，电热恒温培育箱，台式高速离心机，超恒温摇床，电热恒温培育

12、箱，台式高速离心机，超净任务台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度净任务台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液枪，计，微量移液枪， eppendorf管等。管等。 二二. 资料，设备及试剂资料，设备及试剂分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 0.1mol/L的的CaCl2 LB液体培育基液体培育基 LB固体培育基固体培育基 Kana母液：卡那霉素母液：卡那霉素(Kanamycin )母液：配成母液：配成 50mg/ml水溶液水溶液, -20保管备用保管备用 3. 试试 剂剂分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0三三. 操作步骤操

13、作步骤 本实验以本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞菌株为受体细胞,并用并用CaCl2处置处置,使其处于感受态使其处于感受态,然后与质粒共保温然后与质粒共保温,实现实现转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可经过卡那转化。由于质粒带有卡那霉素抗性基因，可经过卡那霉素抗性来挑选转化子。如受体细胞没有转入质粒，霉素抗性来挑选转化子。如受体细胞没有转入质粒，那么在含卡那霉素的培育基上不能生长。能在卡那霉那么在含卡那霉素的培育基上不能生长。能在卡那霉素培育基上生长的受体细胞转化子一定已导入了素培育基上生长的受体细胞转化子一定已导入了质粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进展质粒。转化子扩增后

14、，可将转化的质粒提取出，进展电泳、酶切等进一步鉴定。电泳、酶切等进一步鉴定。 分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 受体菌的培育受体菌的培育 1) 从从LB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E. coli DH5单单菌落菌落,接种于接种于3-5ml LB液体培育基中液体培育基中,37,180rpm振荡培育过夜；振荡培育过夜； 2) 将该菌悬液以将该菌悬液以1:30-100的比例接种于的比例接种于100ml LB液体培育基中，液体培育基中，37振荡培育振荡培育23小时小时至至OD600在在0.5左右左右 ; 3) 无菌条件下取无菌条件下取1.5 ml菌液到菌液到eppe

15、ndorf管中，冰浴管中，冰浴10min，4, 8000rpm离心离心5min; 4) 彻底弃上清液，在冰浴上参与彻底弃上清液，在冰浴上参与500ul预冷预冷的无菌的无菌CaCl2 (0.lmol/L)使细胞悬浮；使细胞悬浮； 分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 5) 4 ,8000 rpm离心离心4min，弃上清液，弃上清液; 6) 用用100l预冷的无菌预冷的无菌CaC12 (0.lmol/L) 重新重新悬浮细胞，冰上备用；悬浮细胞，冰上备用；分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 02. 转化转化 取取50l感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，参

16、与感受态细胞悬液，在冰浴中使其解冻，参与10l衔接产物或质粒衔接产物或质粒DNA(含量不超越含量不超越50ng,体积不体积不超越超越10l)，悄然摇匀，冰上，悄然摇匀，冰上30-40min； A.质粒质粒DNA组：组：10l 质粒质粒DNA +50l感受态细胞悬液感受态细胞悬液 B.空白对照组空白对照组:10ul 无菌水无菌水50l感受态细胞悬液感受态细胞悬液分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 42水浴中热击水浴中热击90秒勿摇动，热击后秒勿摇动，热击后迅速置于冰上冷却迅速置于冰上冷却2min； 向管中参与向管中参与400l LB液体培育基液体培育基(不含卡那不含卡那霉素霉素)，混匀后，混匀后37，180rpm振荡培育振荡培育40min，使细菌恢复正常生长形状，并表达，使细菌恢复正常生长形状，并表达质粒编码的抗生素抗性基因质粒编码的抗生素抗性基因(卡那霉素卡那霉素 )；涂平板：将上述菌液摇匀后取涂平板：将上述菌液摇匀后取80ul涂布于含涂布于含Kana的挑选平板上，在菌液完全被培育基的挑选平板上，在菌液完全被培育基吸收后，吸收后，37倒置培育皿培育倒置培育皿培育1218h。 分分子子生生物物学学2008实实验验2 20 01 10 0 留意：留意：1