细胞生长因子对人晶体上皮细胞转铁蛋白mRNA表达的影响

1、细胞生长因子对人晶体上皮细胞转铁蛋白mRNA表达的影响【摘要】目的分析转化生长因子-1 (transforming growth factor-1,TGF-1)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF) 对培养的人晶体上皮细胞转铁蛋白mRNA表达的影响。方法人晶体前囊膜取材于3岁以下各种原因死亡24h内的20例（40只眼）婴幼儿眼球。晶体上皮细胞原代培养和传代培养，选用传3代汇合后2周的细胞，分别用TGF-1和bFGF作用3天，用异硫氰酸胍、酚、氯仿、异戊醇等抽提细胞总RNA，选择转铁蛋白的核酸探针进行Northern杂交，分析转铁蛋白m

2、RNA的表达强度。结果与对照组比较,TGF-1作用的实验1组和bFGF作用的实验2组转铁蛋白的mRNA表达均显著增强; 实验1组与实验2组比较, 两组转铁蛋白的mRNA表达相同。结论TGF-1和bFGF显著地上调培养的人晶体上皮细胞转铁蛋白mRNA的表达，提示这两种细胞生长因子可减弱转铁蛋白参与的晶体氧化损伤过程，说明它们在与年龄相关的白内障形成和白内障囊外摘除术后发生的后发性白内障的病理机制及过程中起着重要的作用。【关键词】转铁球蛋白晶体上皮细胞生长因子白内障Influence of cell growth factors on transferrin gene expression of

3、human lens epithelial cells in cultureZHONG Lichun, LI Meiyu. Department of Ophthalmology, First School of Clinical Medicine, Beijing Medical University, Beijing 100034【Abstract】ObjectiveTo assess the influence of transforming growth factor-1 (TGF-1) and basic fibroblast growth factor (bFGF) on the

4、transferrin mRNA levels of cultured human lens epithelial cells. MethodsLens anterior capsules were collected from 40 eyeballs of 20 human donors under 3 years of age within 24 hours after death. Lens epithelial cells were primarily cultured and subcultured. TGF-1 (1 g/L) and bFGF (250 g/L) were add

5、ed to the 3rd passage cells when they became confluent after their growth for 2 weeks. The total cellular RNA was extracted from cultured cells by guanidine isothiocyanate, etc. after the growth factors acting for 3 days. Transferrin mRNA levels were determined by a Northern blot analysis with a pro

6、be. ResultsIn comparison with the control group, the expressions of transferrin in the growth factor treatment groups were obviously increased. In comparison with bFGF group, transferrin mRNA level in TGF-1 group was obviously increased. ConclusionsTGF-1 and bFGF upregulate transferrin gene expressi

7、on of cultured lens epithelial cells remarkably, can reduce lenticular oxidative damaging process in which transferrin participates and play an important role in the pathological mechanism of cataract formation after extracapsular cataract extraction.【Key words】TransferrinLensEpithelial cellsGrowth

8、factorCataract白内障是重要的全球性致盲疾病之一，与年龄相关的白内障严重影响老年患者的视功能，后发性白内障是白内障囊外摘除术后影响视功能恢复的主要并发症之一。近年的研究表明，各种白内障发生的病因较为复杂，晶体的氧化损伤是白内障形成的最初因素。在眼内，转铁蛋白被认为具有抗炎、抗菌的作用，以及在导致白内障形成的晶体氧化损伤过程中抗氧化的作用。眼内各种因素如细胞生长因子等，参与及调节晶体的氧化过程，并影响晶体损伤的程度。本研究是通过细胞生长因子影响培养的人晶体上皮细胞转铁蛋白mRNA的表达，以探讨白内障形成机制及开发防治白内障的药物。材料与方法1.标本来源：各种原因死亡的3岁以下儿童，共

9、20例（40 只眼），无眼部疾患，死亡24 h内取材。2.人晶体上皮细胞培养1：在实体显微镜直视下，从晶体赤道部后1mm环行剪开后囊，分离前囊膜，在DMEM 培养液(含105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素）中漂洗3次，剪成2 mm2 mm的小片，接种于25 ml培养瓶底部，每瓶接种10片，置于37、5% CO2和100%相对湿度的培养箱内。囊膜小片贴壁2小时后，加入含适量20%胎牛血清的DMEM培养液继续培养，次日换液1次，以后每周换液2或3次。原代培养1个月，上皮细胞生长达到一定数量后，进行传代培养，细胞密度调整至1107个/L，每瓶接种3 ml，用15%胎牛血清DMEM培养液培养1

10、或2周，细胞达到汇合后，再次传代培养。选择第3代生长汇合2周的细胞用于实验。3.细胞总RNA的提取和Northern杂交：选择第3代生长汇合2周的细胞，分为3组，即对照组、实验1组和实验2组。每组弃培养液后用0.01 mol/L PBS洗瓶底3次，对照组加入DMEM 培养液；实验1组加入含1 g/L转化生长因子-1(transforming growth factor-1, TGF-1)的DMEM培养液；实验2组则加入含250 g/L碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的DMEM培养液。在无血清状况下培养3天后，弃培养液，用0.01

11、mol/L PBS洗瓶底3次，每组用细胞裂解液（含异硫氢酸胍和-巯基乙醇等）裂解细胞，酚、氯仿、异戊醇抽提，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，最后用0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解沉淀的RNA。每组测定吸光度(A)值，然后进行变性RNA琼脂糖电泳，将变性RNA转移至硝酸纤维素滤膜，预杂交后用32P标记的转铁蛋白特异的单链DNA探针进行杂交，洗膜后用放射自显影方法，观察与照像，用薄层密度扫描仪测定各组放射自显影的A值。Northren杂交实验重复10次，最后用方差分析F检验将数据进行统计学处理。结果1.对照组、实验1组和实验2组各10个样本（1培养瓶为1个样本）共30个，每个样本的RNA电泳带清

12、晰,A值为1.922.00。2.3组共30个样本，细胞数平均为778万个, 细胞RNA平均为20.36 ng。3.用放射自显影方法显示3组Northern杂交培养的人晶体上皮细胞转铁蛋白mRNA表达的强度，经薄层密度扫描仪测定其A值(1)。4.10次实验结果经统计学处理: 与对照组比较，实验1组和实验2组差异均有显著性（F=4.21,P0.01)（表1），即细胞生长因子TGF-1和bFGF使培养的人晶体上皮细胞转铁蛋白的mRNA的表达增强, 其上调程度相同。1 示对照组(DMEM培养液)2 示实验1组(含1 g/L TGF-1 DMEM培养液)3 示实验2组(含250 g/L bFGF DME

13、M培养液) 11次Northern杂交放射自显影表110次Northarn杂交结果吸光度值组别样品数吸光度值(s)F值P值对照组 10 2.0020.118 4.21 0.01 讨论1.转铁蛋白、铁离子与氧化损伤：转铁蛋白是一种与铁离子功能活动直接相关的-球蛋白,其主要功能是转运铁离子。眼内液（房水和玻璃体）中转铁蛋白的浓度远较血清中浓度高，尤其是在前房炎症、白内障和玻璃体增殖病变过程中，转铁蛋白的浓度比血清中浓度高数十倍。眼内液中的转铁蛋白并非血-房水屏障破坏后血清转铁蛋白单纯渗漏的结果，这一现象引起了人们的关注2。有研究表明，眼内各种细胞包括晶体上皮细胞都具有转铁蛋白mRNA的表达，晶体上

14、皮细胞还可自分泌转铁蛋白3，4。铁离子在氧化还原传递电子的功能活动中，变动于Fe3+与Fe2+之间，为有毒产物如过氧化氢等提供电子，使其生成水。与年龄相关的白内障因各种原因常在晶体细胞代谢过程中产生过多的过氧化氢和超氧阴离子自由基(O?2)等，如其不能及时还原成水，则易造成晶体的氧化损伤。转铁蛋白除具有重要的控制细胞增殖和分化的功能外,在抗炎、抗菌和抗氧化过程中也具有重要作用，推测其在白内障最初形成的氧化损伤过程中可能发挥作用5，6。2.细胞生长因子与白内障：与年龄相关的白内障和白内障囊外摘除术后发生的后发性白内障的形成过程，受到多种因素的综合调节，晶体的氧化损伤是白内障形成的最初因素。细胞生

15、长因子是一类活跃于眼内液中的多肽因子，参与和调节细胞的生理和病理过程。研究表明，在体外培养的晶体上皮细胞中，TGF-1显著抑制该细胞的增殖与分化，而bFGF显著促进其增殖和分化7。在本实验中，二者对培养的人传3代汇合后2 周的晶体上皮细胞中转铁蛋白mRNA的表达，表现为一致的上调作用。这说明二者均有促进转铁蛋白自分泌，加强其抗氧化作用，减轻晶体氧化损伤，阻止白内障形成的作用。TGF-1抑制晶体上皮细胞增殖与分化及上调转铁蛋白抗氧化的作用，有利于抑制白内障的形成和后发性白内障的发生，有望成为防治白内障的药物；但有资料表明，TGF-1可使器官培养的晶体混浊，形成白内障8。bFGF不仅具有上调转铁蛋

16、白抗氧化的作用，还具有调节转铁蛋白释放的作用9，也有望成为防治与年龄相关白内障的药物。本实验仅表明，两种细胞生长因子在一定浓度下单独作用可上调人传3代汇合后2周晶体上皮细胞转铁蛋白mRNA的表达。上述二者能否成为防治白内障的药物，尚有待于进一步的研究。眼内液常是多种细胞生长因子同时存在并有金属离子等其他因素参与的多种复合体。一种细胞生长因子不同浓度作用其结果可能不同；两种或两种以上细胞生长因子同时存在其结果不尽相同；体外培养细胞与人体晶体上皮细胞对各种因素作用的反应也不相同。这些细胞生长因子与年龄相关的白内障的形成及后发性白内障发生的关系, 还需要进一步的研究。作者单位：100034 北京医科

17、大学第一医院眼科参考文献1郭海科,李绍珍,曹心?,等.人类晶体上皮细胞培养及其生长抑制的实验研究.中华眼科杂志,1995,31: 102-104.2Laicine EM, Haddad A. Transferrin, one of the major vitreous proteins, is produced within the eye. Exp Eye Res,1994,59:441-445.3McGahan MC, Harned J, Grimes AM,et al.Regulation of ferritin levels in cultured lens epithelial ce

18、lls.Exp Eye Res,1994,59:551-555.4McGahan MC, Harned J , Goralska M,et al. Transferrin secretion by lens epithelial cells in culture.Exp Eye Res, 1995,60:667-673.5McGahan MC. Does the lens serve as a“sink”for iron during ocular inflammation? Exp Eye Res, 1992,54: 525-530.6McGahan MC,Grimes AM, Fleish

19、er LN. Transferrin inhibits the ocular inflammatory response. Exp Eye Res,1994,58:509-511.7Kurosaka D, Nagamoto T.Inhibitory effect of TGF-2 in human aqueous humor on bovine lens epithelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci,1994, 35:3408-3412.8Hales AM, Chamberlain CG , McAvoy JW. Catara