重组人粒细胞-巨噬细胞刺激因子的摇瓶发酵研究

1、西北大学学报(自然科学网络版) 2004年12月，第2卷，第12期Science Journal of Northwest University Online Dec. 2004，Vol.2，No. 12重组人粒细胞-巨噬细胞刺激因子的摇瓶发酵研究马 莉，白 泉，王骊丽，斯 琴，耿信笃（西北大学 现代分离科学研究所/现代分离科学陕西省重点实验室，陕西 西安 710069）摘 要：为了优化重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子摇瓶发酵工艺，利用摇瓶法选择出最佳的rhGM-CSF的培养条件。结果表明：最佳条件为培养温度32，初始pH值7.27.4，摇床转速200 r/min，种子菌龄在OD600为1.

2、0左右时接种，并在对数生长前期0.50.8之间诱导4 h。在此优化的培养条件下，在摇瓶中使用M9培养基时，rhGM-CSF的表达量占菌体总蛋白的24.3%，OD600达5.35，说明构建的rhGM-CSF工程菌发酵的稳定性和重复性良好，可为rhGM-CSF的大规模生产提供可靠的放大依据。关 键 词：重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；大肠杆菌；摇瓶发酵中图分类号：TQ920.6 文献标识码：A 文章编号：1000-274X(2004)0117-08人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colony stimulating factor, hG

3、M-CSF)是一种重要的造血调控因子1，对各种原因尤其是癌症患者化疗后引起的白细胞减少症有明显的疗效。由于天然人GM-CSF来源有限，产量甚微，不能满足科研和临床的需要，1985年Wong等人克隆了人GM-CSF cDNA，并实现了表达2,1993年张智清等人在国内首次克隆了人GM-CSF cDNA，并在大肠杆菌中获得表达3。近年来，许多科研人员也致力于这方面的研究，并取得了成功46。本文作者也克隆出了人GM-CSF cDNA，实现了在大肠杆菌中的表达。为了进一步开发研究，实现rhGM-CSF的产业化，本文以提高其表达量和细胞产量为目标，对重组大肠杆菌的摇瓶培养条件进行了研究，确定出最佳生产重

4、组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的培养条件，为以后的大规模发酵生产奠定基础。 1 材料和方法1.1 材 料工程菌：菌种pDH/rhGM-CSF/DH5，由本所分子生物学实验室构建。试剂：酵母粉（Yeast extract，OXOID公司产品），蛋白胨（Tryptone，OXOID公司产品），琼脂糖（Agar powder，日本进口分装公司，上海化学试剂站分装厂），氯化钠、氢氧化钠、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁、氯化铵均为分析纯。1.2 方 法1.2.1 一级种子的制备 选用LB培养基，其组成（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母粉5.0，氯化钠10.0，氨苄青霉素0.1，pH调至7.0，

5、1.034105 Pa 高压灭菌20 min。将种子接入其中后，于30，200 r/min的摇床_收稿日期：2004-06-02审 稿 人：申烨华，女，西北大学化学系副教授。内培养过夜，OD600达1.0左右时即可进行转接。1.2.2 发酵培养 选用M9培养基，其组成（g/L）：胰蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，Na2HPO4 12H2O 17.1，KH2PO4 3.0，NaCl 0.5，NH4Cl 1.0，氨苄青霉素0.1，pH调至7.2，1.034105 Pa 高压灭菌20 min。1.2.3 菌体密度的测定 用721型分光光度计在600 nm波长下测定OD600值。1.2.4

6、 表达量的测定 取500L发酵液离心，弃上清液，向菌体中加样品缓冲液。其组成为50 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8），50 mmol/L DTT，2% SDS，0.1% 溴酚蓝和10% 甘油，然后搅拌均匀，沸水煮5min，离心。走SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R250染色，用Cs-930双波长扫描仪（Shimadzu）扫描测定rhGM-CSF表达量。2 结果与讨论2.1 培养温度对工程菌生长的影响微生物的生长和产物合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境。本实验中选择培养温度27、30、32、35C进行考察，实验结果

7、见图1。 27, 30, 32, 35图1 培养温度对重组大肠杆菌生长情况的影响Fig.1 Effect of culture temperature on the the growth of bacteria从图1可看出，在27、30和32C培养时菌体密度均能达到5.00，但在32C时为最高。其原因是在较低温度(如27C)进行培养时细菌的生长代谢缓慢，菌体不能得到充分的增殖，而在较高温度(如35C)进行培养时，虽然生长迅速，但代谢加快，生产期提前，对葡萄糖的利用过多，排谢出大量的代谢副产物（如乙酸等），抑制了菌体的生长，因而菌体密度较低7。所以，以下实验均控制培养温度在3032C。2.2 诱

8、导时机对工程菌生长和rhGM-CSF表达的影响基因工程菌的两阶段培养法是为了在扩大菌体密度的同时，尽可能提高工程菌的表达水平，因此诱导时机是至关重要的因素，在研究温控诱导策略时应先确定最佳的诱导时机。图1显示出所用大肠杆菌pDH/rhGM-CSF/DH5在32培养时的生长曲线。从图1可见：13 h为延迟期，OD600刚到0.3左右；410 h为对数生长期，OD 600从0.5迅速增加到4.3；1114 h为稳定期，OD 600变化不大；14 h以上为衰亡期，OD 600下降。以此为依据，在不同生长期(对数生长初期、中期和后期)，OD 600在0.3、0.5、0.8、1.0、2.0左右时分别升温

9、至42 C诱导，诱导表达4 h，实验结果见表1。表1 诱导时机对菌体生长和rhGM-CSF表达的影响Tab.1 Effects of induction time on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF诱导时OD 6000.35 0.52 0.81 1.10 2.05由表1可见：在菌体的对数生长前期（OD 600=0.52、0.81）进行诱导可获得较高的表达量，在OD 600=0.35时诱导，由于菌体没有充分增殖就担负起表达外源基因产物和分裂后代的双重任务，势必难以获得较高的菌体产量，比OD 600大约0.5时诱导的产量低；当在

10、对数生长中后期（OD 600=1.10、2.05）进行诱导时，此时菌体虽充分增殖，但由于生存环境已经恶化，pH下降，部分营养物质减少甚至缺乏，使得工程菌的活力衰弱，不能给基因表达提供大量活力旺盛的细胞。因此，最好选择在OD 600为0.50.8之间升温诱导。菌体密度OD 6003.652 5.191 5.245 4.783 4.232rhGM-CSF 表达量/%16.4 20.8 20.4 13.2 10.12.3 诱导表达时间对工程菌生长和rhGM-CSF表达的影响采用两阶段培养法，在菌体生长到OD 600 0.5时升温42诱导，考察表达时间对菌体生长和表达的影响，试验结果见图2。OD 60

11、0， rhGM-CSF表达量图2 诱导表达时间对菌体生长和rhGM-CSF表达的影响Fig.2 Effects of expression time on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF由图2可看出，诱导45 h之后，菌体密度与表达量均达最大值。这可能是因为：诱导后第23 h，细菌培养物仍处于对数生长期，菌液密度较小，细菌培养物还在不断繁殖，故此阶段菌体密度和表达量都处于上升期；诱导45 h后，细菌进入对数生长后期，培养液中细菌浓度趋于稳定，表达也达最高；继续诱导，培养基营养成分不足，生存环境已经恶化，菌体密度有所下降，表达量

12、下降幅度较大。2.4 pH值对工程菌生长和rhGM-CSF表达的影响培养基的pH值影响培养基中某些物质和中间代谢产物的解离，从而影响微生物对营养成分的吸收和代谢。因此，各种微生物都有最适生长的pH值范围，超出这个范围，菌体的生长就会受到影响甚至停止。在工程菌的摇瓶发酵过程中，培养基的初始pH值是一个重要参数，它对于细胞的正常生长和外源基因的高效表达都有影响8。本实验中采用初始pH值分别为6.67.6的培养基，考察对菌体生长和rhGM-CSF表达的影响，实验结果见图3。OD600， rhGM-CSF表达量图3 培养基初始pH值对菌体生长和rhGM-CSF表达的影响Fig.3 Effects of

13、 initial pH of culture media on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF从图3中发现，培养基初始pH值对工程菌生长和rhGM-CSF表达的影响趋势基本一致，均有一个最优值，当pH为7.2时，rhGM-CSF的表达处于最佳，当pH在7.4时的菌体密度最高，表达量稍稍次之。一般情况下，E.coli表达外源蛋白的最适pH为6.06.59，而在此优化的初始pH在7.2或7.4。这是因为摇瓶发酵过程中，不断产生乙酸等代谢废物，使得培养基的pH下降。因此，培养基的初始pH应控制在7.27.4。2.5 接种量对工程菌生

14、长和rhGM-CSF表达的影响接种量的大小影响发酵的产量和发酵周期。接入适量的种子，由于种子液中含有大量的体外水解酶类，有利于对基质的利用，可以缩短生长的延迟期，并且使生产菌迅速占据了整个培养环境，可减少杂菌生长的机会。但是，如果接种量过多，往往使菌体生长过快，一方面会使培养液粘度增加，造成溶解氧不足，影响产物的合成，另一方面会加剧工程菌质粒的丢失，使菌体表达外源蛋白的能力下降10。同样，如果接种量过小，就会使发酵周期延长，不利于外源基因表达。本实验中采用不同的比例接种，考察对菌体生长和rhGM-CSF表达的影响，实验结果见表2。表2 接种量对菌体生长和rhGM-CSF表达的影响Tab.2 E

15、ffects of inoculum volumes on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF接种量/%1234从表2可见，无论从发酵菌体量还是从rhGM-CSF表达量上看，当接种量为3时两者均为最高，因此采用适当的接种量有利于重组菌的生长和外源基因的表达，以后实验中采用3的接种量。 OD600 3.55 4.27 5.34 5.12 4.87 表达量/% 15.3 17.9 21.6 19.3 16.92.6 摇床转速对菌体生长和rhGM-CSF表达的影响不同摇床转速对工程菌生长和rhGM-CSF表达的影响如表3所示。表3 摇床

16、转速对菌体生长和rhGM-CSF表达的影响Tab.3 Effects of rotational speed on the growth of bacteria and expression of rhGM-CSF转速/rmin-1140160180200220表3结果显示，随着转速的提高，rhGM-CSF菌体密度也提高，当转速为220 r/min时，菌体密度最高，而菌体表达量先增加后降低，转速为200 r/min时表达最好。这说明转速越高，旋转时发酵液与空气接触面积越大，氧气传质越快，供氧量能够满足菌体生长的要求11；当转速低时供氧量不足，菌体生长缓慢，rhGM-CSF表达量较低，因此可以提

17、高摇床转速来提高外源蛋白的产量。通常生产中需要考虑的是rhGM-CSF的产量，因此需综合考虑菌体密度和rhGM-CSF表达量这两个因素作为优化指标。OD600与细胞干重成正比，所以用OD600乘以rhGM-CSF表达量的数值，表征其产量。200 r/min和220 r/min时，该数值分别为115.8和111.9，可见200 r/min优于220r/min，所以摇床转速选定在200 r/min左右。 OD600 4.235 4.764 5.016 5.125 5.205 rhGM-CSF表达量/% 16.1 18.7 20.4 22.6 21.52.7 种子菌龄对工程菌生长和rhGM-CSF表

18、达的影响种子液质量的优劣对发酵生产起着关键的作用，若将过于年轻的种子接入摇瓶中，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵过程周期延长、产物形成的时间推迟等现象，甚至会因菌体量过少而在发酵中结球，造成异常发酵。然而，菌龄过老，又会引起菌种生产能力的下降。因此，我们在实验中将不同菌龄的种子液按3%的接种量接于M9培养基中，培养OD600至 0.5左右，升温至42诱导表达4 h，实验结果见表4。 5表4 种子菌龄对菌体生长和rhGM-CSF表达的影响Tab.4 Effects of inoculum age on the growth of bacteria and expression of rhGM-C

19、SF种子菌龄OD6000.5 1.0 1.5 2.0终止OD600 4.689 5.132 4.725 4.489rhGM-CSF表达量/%16.1 23.8 20.4 18.5由表4可见，种子液OD600在0.52.0时，随种子液浓度增高，发酵液的终止OD600先升后降，而rhGM-CSF的表达量亦有一最佳值。综合考虑细胞密度和rhGM-CSF的表达量，选择种子菌龄的OD600为1.0左右时较为合适。3 结 论通过对工程菌pDH/rhGM-CSF/DH5摇瓶发酵工艺条件的研究，确定出摇瓶发酵的最优培养条件：培养温度32；初始pH值7.27.4；摇床转速200 r/min；种子菌龄在OD600

20、为1.0左右时进行接种；培养至OD600 0.50.8，升温至42诱导表达4 h。用选定的优化条件，发酵3批，结果见表5，电泳结果见图4，rhGM-CSF的表达量平均24.3%，平均OD600可达5.35。由此可见，用我们构建的工程菌发酵的稳定性和重复性良好，可为rhGM-CSF的大规模生产提供可靠的放大依据。表5 优化条件下的实验结果Tab.5 The experimental results under optimal conditions 实验批次1 2 3 平均OD600 5.445 5.238 5.369 5.3500.112rhGM-CSF表达量/%24.2 24.7 23.9 2

21、4.30.4rhGM-CSF图4 摇瓶优化条件下SDS-PAGE图Fig.4 The SDS-PAGE under optimal conditions in shaking flask参考文献：1 METALF D. The granulocyte-macrophage colony stimulating factorsJ. Science，1985，229：16-22.2 WONG G G，WITEK J S. Human GM-CSF：molecular cloning of the complementory DNA and purification of the natural r

22、ecombinant proteinsJ. Science，1985，228：810-815.3 张智清，张 颖，路秀华，等. 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子cDNA5端的修饰提高其在大肠杆菌的表达J. 病毒学报，1993，9(2)：136-143.4 王嘉玺，邹民吉，黄碧莲，等. 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在大肠杆菌中的克隆与表达J. 生物工程学报，1995，11(1)：33-38.5 姚 军，甘人宝，张 倩，等. 人GM-CSF cDNA的克隆和在大肠杆菌中的表达J. 生物化学与生物物理学报，1996，28(3)：265-271.6 段淑敏，李福胜，杨新科，等. 大肠杆菌表达的rhGM

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25、aration Science, Northwest University, Xian 710069, China)Absract: Fermentation technology of recombination E.coli expressing human granulocyte-macrophage colony stimulating factor(hGM-CSF) with shaking flask was optimized for rhGM-CSF. The experimental results show that the optimum conditions are: