血管内皮生长因子先兆子痫大鼠肾损伤中作用

1、血管内皮生长因子先兆子痫大鼠肾损伤中作用【摘要】 目的 研究血管内皮生长因子（VEGF）在先兆子痫大鼠肾损伤中的作用。方法 采用一氧化氮合酶抑制剂复制大鼠先兆子痫模型，通过双抗酶联免疫吸附法检测血浆及尿液中VEGF含量，应用原位杂交法测定肾小球VEGFmRNA转录水平，利用免疫组化法检测肾小球VEGF蛋白表达情况。结果 在先兆子痫大鼠中，尿液中VEGF含量（以尿VEGF/尿肌酐表示）升高且与肾脏局部VEGF的表达强度呈正相关，肾小球局部VEGFmRNA和VEGF蛋白表达均增强，且表达的强度与24h尿蛋白排泄量呈正相关。结论 尿液VEGF可能来源于肾脏局部的分泌，肾小球VEGF可能参与了先兆子痫

2、中大量蛋白尿的产生。 【关键词】 血管内皮生长因子；先兆子痫；蛋白尿 【Abstract】 Objective To investigate the effect of vascular endothelial growth factor(VEGF) in kidney lesion of rats with preeclampsia.Methods A rat model of preeclampsia was developed by inhibitor of nitric oxide synthase. Plasma and urinary VEGF were determined us

3、ing a sandwich enzyme immunoassay. The level of VEGFmRNA in glomeruli was measured by in situ hybridization. The expression of VEGF protein in glomeruli was detected by immunohistochemistry method.Results In rats with preeclampsia， urinary VEGF levels (expressed as VEGF/creatinine ratio) were signif

4、icantly higher and positively correlated to the expression of VEGF in glomeruli， the level of VEGF mRNA and the expression of VEGF were significantly higher than other groups. There was a positive correlation between the expression of VEGF in glomeruli and 24 h urinary protein excretion.Conclusion C

5、orrected urinary VEGF levels can stand for the expression of VEGF in glomeruli. VEGF in glomeruli might be involved in the mechanism of proteinuria in preeclampsia. 【Key words】 vascular endothelial growth factor； preeclampsia； proteinuria 先兆子痫是引起孕产妇及围生儿死亡的重要原因，肾脏损伤所致的大量蛋白尿为其主要的临床表现。引起肾小球滤过膜通透性增高的原因目

6、前不详。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种强效的增强血管壁通透性的生物活性物质1。有研究表明血浆及胎盘蜕膜局部VEGF水平的改变可能与妊高征的发病有关。但血浆、尿液VEGF水平与肾脏局部VEGF表达的关系及肾脏局部VEGF的表达与先兆子痫肾损伤的关系至今国内外尚未有研究。本试验拟通过一氧化氮合酶抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯（L-nitro-arginine，L-NAME）复制大鼠先兆子痫模型2，检测血浆、尿液中VEGF浓度，观察肾小球中VEGF的表达及其表达的强弱与24h尿蛋白排泄量的关系，从而探讨VEGF在先兆子痫肾损伤中的

7、作用。 1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器 L-NAME（美国Sigma公司），VEGF Elisa试剂盒（北京中山生物有限公司），地高辛标记的VEGFmRNA探针（德国Biognostik公司），VEGF多克隆抗体（Santa Cruz公司），SABC试剂盒（武汉博士德生物制品公司），大鼠尾动脉袖带式血压计（由同济医学院心血管研究中心提供），透射电镜（由同济医学院超微病理学教研室提供），计算机病理图像分析仪（由同济医学院清屏影像公司提供）。 1.2 动物模型复制与分组 取200250g普通级Wistar雄性大鼠50只和成年Wistar雄性大鼠25只（由同济医学院实验动物学部提供），按雌：

8、雄=2：1比例同笼混合饲养一夜后，次日清晨当雌性大鼠阴道涂片检查可见活动的精子时，确认为大鼠妊娠第1d。将孕鼠随机分为两组，A组：先兆子痫模型组（n=6），B组：正常妊娠对照组（n=6）。另取6只无妊娠史雌性大鼠作为C组，即未孕L-NAME处理组。从妊娠第18d开始对A组和B组大鼠分别皮下注射L-NAME和蒸馏水250mg/（kgd），持续4d后于妊娠第22d时处死。C组大鼠于皮下注射L-NAME 250mg/（kgd），持续4d后处死。 1.3 24h尿蛋白排泄量的测定 用标准代谢笼分别与注射前和注射第2、4d收集各组大鼠24h尿液，采用考马斯亮蓝结合法测定24h尿蛋白排泄量。 1.4 收缩

9、期血压的测定 A组和C组大鼠于L-NAME注射前及L-NAME注射第2、3、4d测量尾动脉收缩压。具体方法是将大鼠置于预热箱内预热至3840，待其安静后用大鼠尾动脉血压仪在5min内连续测量3次收缩期血压，取平均值。 1.5 血浆及尿液标本的采集与检测 在注射第4天时经眼静脉窦采集各组大鼠静脉血2ml，置于经肝素抗凝的玻璃管，3000r/min离心10min后取上清液，置于-70冰箱保存待检。大鼠处死后经膀胱穿刺收集各组大鼠尿液，3000r/min离心10min取上清3ml存放于-70冰箱保存待检。采用双抗酶联免疫吸附法（ELISA），通过绘制标准曲线求出标本VEGF的浓度，为了纠正尿液浓度不

10、同的影响，尿液VEGF含量以尿VEGF/尿肌酐（ng/mmol Cr）来表达。 1.6 原位杂交法 大鼠处死后，取一侧肾组织将其置于4%多聚甲醛液12h、脱水、透明、浸蜡、包埋、连续切片后，具体操作步骤按VEGFmRNA 原位杂交试剂盒说明书进行。实验设不加探针的阴性对照。显微镜下胞浆呈黄色颗粒状为阳性。 1.7 免疫组织化学法 VEGF蛋白用免疫组织化学法检测，具体操作步骤见试剂盒说明书。实验均设不加一抗的阴性对照。显微镜下胞浆呈棕黄色颗粒状者为阳性，蛋白表达强弱用吸光度（absorbance，A）表示。每张切片随机选取5个肾小球，用免疫组化分析软件（HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文

11、报告分析系统）计算VEGF阳性着色细胞吸光度。 1.8 统计学方法 实验数据以xs表示，组间数据差异的显著性分析，方差齐者采用t检验，方差不齐时采用t检验。 2 结果 2.1 24h尿蛋白排泄量 A组大鼠L-NAME注射第2d时24h尿蛋白排泄量（35.1611.31）mg/24h较注射前（4.521.00）mg/24h增高，注射第4d时24h尿蛋白排泄量（55.4120.25）mg/24h更高，P均0.01。注射前各组大鼠24h尿蛋白排泄量间无统计学差异（P0.05）。注射后，同一时间段内，A组大鼠24h尿蛋白排泄量较B组（P0.01）及C组（P0.01）有显著性增高，见表1。 表1 各组大

12、鼠24h尿蛋白排泄量 (xs，n=6，mg/24h)注：与A组比较*P0.01，与注射前比较P0.01 2.2 收缩期血压 A组和C组大鼠注射L-NAME后，血压进行性上升。注射前两组大鼠血压间无统计学差异（P0.05）。注射L-NAME后，同一时间点上，A组大鼠血压明显高于C组，两组间有显著的统计学差异（P0.01），见表2。 表2 A组和C组大鼠收缩期血压 （xs，n=6，mmHg）注：与C组比较*P0.01 2.3 血浆、尿液及肾脏局部VEGF的表达水平 A组大鼠血浆及尿液VEGF含量显著高于B组和C组（P0.05）。A组大鼠肾小球内VEGF mRNA转录水平较B组和C组升高。而且A组肾

13、小球局部VEGF蛋白的表达（A=0.3520.021）较B组（A=0.3230.134）和C组（A=0.3250.014）增强，差异均有显著性（均为P0.05），见表3。各组大鼠VEGF主要表达于足细胞及集合管上皮细胞，VEGF的分布在各组间无差异。表3 血浆、尿液及肾脏局部VEGF的表达水平 (xs)注：与A组比较，*P0.05 2.4 相关分析 本研究表明尿液中VEGF的含量（ng/mmol Cr）与肾小球局部VEGF蛋白表达的强度呈正相关（r=0.79，P0.01）；肾小球局部VEGF蛋白表达的强度与24h尿蛋白排泄量呈正相关（r=0.84，P0.01）；尿液VEGF水平与血浆VEGF水

14、平无相关性（r=0.47，P0.05）；血浆VEGF的水平与肾脏局部VEGF的表达强度无相关性（r=0.28，P0.05）。 3 讨论 3.1 VEGF的生物学特性 VEGF是一46ku的肝素结合糖蛋白，它具有促进内皮细胞有丝分裂、诱导单核巨噬细胞趋化与激活等多种生物功效，但它最主要的功能是增强血管壁的通透性。VEGF增强血管通透性的能力，以摩尔为单位计算，是组织胺的50000倍左右。在肾脏中，肾小球脏层上皮细胞（足细胞）是产生VEGF的主要部位。 3.2 VEGF与先兆子痫肾损伤 本实验成功地复制了大鼠先兆子痫模型。于大鼠妊娠第18d开始经皮下注射L-NAME 250mg/（kgd），持续4

15、d，该模型组大鼠的24h尿蛋白排泄量、收缩期血压较正常妊娠组及未孕L-NAME处理组均有显著升高。同时我们还观察到先兆子痫模型组大鼠大腿内侧呈凹陷性水肿。以上各项指征及大鼠肾脏病理形态学改变与Molnar等2的报道类似。 通过原位杂交技术及免疫组化技术，我们发现在大鼠先兆子痫模型中，VEGFmRNA 及VEGR蛋白的表达较正常妊娠组及未孕L-NAME处理组均有显著增强。但它们在肾组织中的分布与正常者相比无改变。先兆子痫模型中，肾小球VEGF表达增强，这可能是由缺氧所诱导的。因为妊高症最基本的病变为全身小动脉痉挛，这将导致全身各脏器，包括肾组织缺血、缺氧，而许多研究均证实在缺氧状态下，VEGF的

16、表达是上调的1。另外，与先兆子痫发病相关的各种因素，如牵拉力、Ang和一系列细胞因子，也可使VEGF表达上调1。 在肾小球中，足细胞分泌的VEGF以旁分泌的方式作用于肾小球毛细血管内皮细胞上的VEGFR发挥其增强血管壁通透性的效能3。另外VEGF与肾小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）4有着高度的亲和力，可与GBM中富含阴离子的硫酸肝素蛋白多糖发生作用，导致基底膜阴离子位点的减少5。因此VEGF可通过减少肾小球基底膜阴离子的数目5以及诱导内皮细胞小窗的形成6，上调参与循环大分子跨内皮转运的囊泡（vesicular vacuolar organelle，

17、 VVO）的功能7，增强内皮细胞胶原酶的表达和活性，促进胶原降解8等多条途径同时影响肾小球滤过膜的电荷屏障和机械屏障。VEGF表达的异常增强可以引起肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增加，导致蛋白尿的形成。VEGF在蛋白尿中的作用已被大量研究证实。Horita等9报道在牛血清白蛋白诱导的蛋白超负荷肾病变中以及Bailey等10发现在微小病变肾病患者中，VEGF在肾小球中的表达上调且与蛋白尿的严重呈正相关。Kanellis等11报道在嘌呤核苷肾病及被动型Heymann肾炎中VEGFmRNA表达上调，且先于蛋白尿的发生，参与了肾小球损伤的发生发展。Lenz T等12发现在2型糖尿病患者中，尿VEGF浓

18、度与尿蛋白排泄量呈正相关。 在本实验中，我们发现尿液VEGF水平与肾脏局部VEGF表达强度呈正相关，而与血浆VEGF的浓度无相关性，并且血浆VEGF水平与肾脏VEGF的表达强度也无相关性，这提示，尿液中的VEGF主要来源于肾脏局部的分泌，它可以作为反映肾脏局部VEGF表达的一易于检测的指标。本研究还发现先兆子痫大鼠肾脏局部VEGF表达的强弱与蛋白尿的严重程度呈正相关，这提示肾小球VEGF可能参与了先兆子痫中蛋白尿的发生。关于肾小球VEGF在先兆子痫肾损伤大量蛋白尿的产生中究竟起到多大的作用及其作用机制还需利用VEGF特异性的拮抗剂及其他方法作进一步研究，以期为临床防治先兆子痫中肾脏的损伤提供线

19、索。 【参考文献】 1 Ferara N. Vascular endothelial growth factor ： basic science and clinical progress. Endocrine REV， 2004，25： 581-611. 2 Molnar M，Suto T，Toth T，et al. Prolonged blockade of nitric oxide synthesis in gravid rats produces sustained hypertension， proteinuria， thrombocytopenia， and intrauterin

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21、l expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and its receptor VEGFR-2 in experimental diabetes. Diabetes，1999，48：2229. 5 Maruyama K， Tomizama S， Shimabnknro N ，et al. Effect of supernatants derived from T lymphocyte culture in minimal change nephrotic syndrome on rat kidney capillaries.

22、Nephron， 1989，52：73. 6 Roberts WG， Palade GE. Increased microvascular permeability and endothelia fenestration induced by vascular endothelial growth factor. J Cell Sci，1995，18，08：2369. 7 Qu H，Nagy J A， Sanger D R ，et al. Ultrastructural localization of vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) to the abluminal plasma membrane and vesicular vacuolar organelles of tumor microvascular endothelium. J Histochem Cytochem， 1995， 43：381. 8 Unemori E N，Ferrara N，Bauer E A ，et al. Vascular endothelial growth factor induces inter