微生物的实验室培养-上课用

1、到目前为止，到目前为止， 几十项几十项Nobel生理学和医学奖，化学奖生理学和医学奖，化学奖 都与微生物学有关都与微生物学有关微生物的类群微生物的类群原生生物：原生生物：原核生物原核生物:真菌真菌:病毒病毒:如酵母菌如酵母菌单细胞的动植物单细胞的动植物如草履虫、单细胞藻类等如草履虫、单细胞藻类等微生物包含了除微生物包含了除植物界植物界和和动物界动物界以外的所有生物以外的所有生物无细胞结构无细胞结构真核细胞真核细胞细菌、蓝藻细菌、蓝藻原核细胞原核细胞微生物的分类微生物的分类课题1 微生物的实验室培养1.提供营养和条件2.防止污染一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物生存的环境

2、和营养物质1.1.基本成分：基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐碳源碳源无机碳源：无机碳源：有机碳源：有机碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自养微生物自养微生物异养微生物异养微生物氮源氮源无机氮源：无机氮源：有机氮源：有机氮源：NHNH4 4、NONO3 3- -牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等注：含注：含CHONCHON的的有机物有机物是是异异养型微生物的养型微生物的碳源碳源、氮源氮源、能源能源一一. .培养基：培养基：微生物生存的环境和营养物质微生物

3、生存的环境和营养物质1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、无机盐碳源、氮源、水、无机盐2.2.特殊营养：特殊营养：维生素、碱基等维生素、碱基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH3.pH、氧气的需求：、氧气的需求：4.4.种类：种类：固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基有有无无 凝固剂琼脂凝固剂琼脂分离分离 鉴定鉴定工业工业 生产生产化学成分：化学成分：物理性质：物理性质：天然培养基天然培养基 合成培养基合成培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基 是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。1000ml10

4、00ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNacl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g分析营养构成？分析营养构成？5. 5. 配制原则配制原则目的明确：目的明确：营养全面、浓度适宜、比例恰当营养全面、浓度适宜、比例恰当适宜的适宜的pHpH值：值：有机碳源有机碳源异养型：异养型：根据微生物的根据微生物的种类、培养目的种类、培养目的选择原料选择原料自养型：自养型： 不加碳源不加碳源加入缓冲剂加入缓冲剂细菌偏碱，真菌偏酸细菌偏碱，真菌偏酸（COCO2 2作为碳源）作为碳源）生产生产科研科研生产生产科研科研 有些细菌在一定的条件下

5、，细胞里面形成一个椭圆形的休眠有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做体，叫做芽孢芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3 3小时以小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌. .芽孢（胞）芽孢（胞）耐高温需保持干燥的耐高温需保持干燥的 物品，物品，160170 1

6、2小时小时接种环、接种针等接种环、接种针等 金属用具金属用具7075、30min 80、15min100、56min消毒消毒灭菌灭菌定义定义方法方法较为较为温和温和理化方法，理化方法，杀死杀死部分有害菌体部分有害菌体（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）强烈强烈的理化方法，的理化方法，杀死杀死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化学药剂化学药剂紫外线紫外线灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌培养基，培养基，100KPa、121、1530min二二. .无菌技术：无菌技术：获得纯

7、净培养物关键是防止外来杂获得纯净培养物关键是防止外来杂菌的污染菌的污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：请你判断以下材料或用具是否需要消毒或请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒、试管、烧瓶和吸管（3 3） 实验操作者的双手实验操作者的双手2.2.无菌范围：无菌范围：实验操作空间消毒实验操作空间消毒操作者的手、衣着消毒操作者的手、衣着消毒实验用具和培养基等灭菌实验用具和培养基等灭菌实验操作过程实验操作过程二二. .无菌技术：无菌技

8、术：防止外来杂菌的污染防止外来杂菌的污染1.1.消毒与灭菌：消毒与灭菌：酒精灯旁操作酒精灯旁操作超净工作台超净工作台单个单个或少数菌体或少数菌体2.2.特征：特征：大小、形状、光泽度、大小、形状、光泽度、颜色、透明度等。颜色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定义：定义：三三. .菌落菌落鉴定菌种鉴定菌种的重要依据的重要依据固体固体培养基上培养基上大量繁殖大量繁殖子细胞群体子细胞群体1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O 定容至定容至1000mlNaCl 5g蛋白胨蛋白胨 10g牛肉膏牛肉膏 5g琼脂琼脂20.0g四四. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆

9、菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1.1.计算：计算：培养基用量培养基用量依配方计算各成分的用量依配方计算各成分的用量2.2.称量：称量：3.3.溶化：溶化：牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏黏稠，用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、蛋白胨易吸潮，要快、加盖牛肉膏、称量纸牛肉膏、称量纸 、少量水加热溶解、少量水加热溶解 取纸取纸蛋白胨、蛋白胨、NaClNaCl琼脂琼脂 补水定容补水定容4.4.调调pHpH、分装、封口：、分装、封口：5.5.灭菌：灭菌：6.6.倒平板：倒平板：培养基、培养皿培养基、培养皿分散成单个细胞分散成单个细胞, ,形成单个菌落形

10、成单个菌落约约50防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染灼烧灭菌，灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基防止瓶口的微生物污染培养基二二. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：平板划线法：平板划线法：菌种菌种划划3 3个平板个平板1 1个不划线个不划线1.1.接种：接种：接种环接种环防止划破培养基防止划破培养基（重复实验）（重复实验）（空白对照）（空白对照）6 6支试管，分别加入支试管，分别加入9ml9ml无菌水无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051

11、ml106稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：菌液菌液微量微量 移移液器液器稀释涂布平板法：稀释涂布平板法：a.a.梯度稀释菌液：梯度稀释菌液：b.b.涂布平板：涂布平板：不超过不超过0.1ml0.1ml各梯度分别涂布各梯度分别涂布3个平板个平板1 1个不涂布作空白对照个不涂布作空白对照滴滴灼灼试试涂涂稀稀释释10103 3倍倍稀稀释释10104 4倍倍稀稀释释10105 5倍倍平板划线法：平板划线法：二二. .大肠杆菌的纯化培养：大肠杆菌的纯化培养：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基纯化大肠杆菌：纯化大肠杆菌：1.1.接种：接种：稀释涂布平板

12、法：稀释涂布平板法：2.2.培养：培养：将将接种后接种后的培养基和一个的培养基和一个未接种未接种的培养基的培养基放入放入3737恒温箱中培养恒温箱中培养12h12h24h24h后，后，观察并记录观察并记录三三. .菌种的保藏：菌种的保藏：1.1.临时保藏：临时保藏： 试管固体斜面培养基上试管固体斜面培养基上442.2.长期保存：长期保存：菌种易被污染、变异菌种易被污染、变异甘油管藏甘油管藏1ml1ml甘油甘油1ml1ml菌液菌液2020为什么在操作的第一步以及每次划线之前都为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？灼烧接种环吗？为什么？操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物可能存在的微生物污染培养物杀死上次