酶促反应动力学-多底物动力学课件

1、酶促反应动力学-多底物动力学1 第二节第二节 多底物反应及其动力学多底物反应及其动力学 一一 反应机制的分类：反应机制的分类： (一一) Cleland表示法的基本符号和概念：表示法的基本符号和概念： 底物：依照底物与酶结合的顺序依次用底物：依照底物与酶结合的顺序依次用 A、B、C、D表示表示 产物：根据产物从酶上脱落的顺序用产物：根据产物从酶上脱落的顺序用 P、Q、R、S 表示表示 游离酶：游离酶：E、F、G 抑制常数：抑制常数：KiA 、KiB ; KiP 、 KiQ 米氏常数：米氏常数：KmA、KmB; KmP 、 KmQ 抑制剂：抑制剂：I 修饰剂：修饰剂：X或或Y 反应分子数反应分子

2、数: Uni(单单) 、Bi(双双)、 Ter(三三) 、Quad(四四) 酶促反应动力学-多底物动力学2 酶反应中间物：分为两类酶反应中间物：分为两类 (1) 稳态中间物稳态中间物： 指酶和底物以共价键结合形成的较为稳定的中间物。可指酶和底物以共价键结合形成的较为稳定的中间物。可 以发生双分子反应而不能自身解离。例如：某些以发生双分子反应而不能自身解离。例如：某些Ser蛋白酶蛋白酶 在催化过程中形成的酰化酶中间物在催化过程中形成的酰化酶中间物 包括：共价结合的包括：共价结合的ES中间物；自由酶中间物；自由酶 (2) 过渡态复合物过渡态复合物： 非稳定的酶中间物，本身可以单分子解离或异构化之后

3、非稳定的酶中间物，本身可以单分子解离或异构化之后 再解离出产物或底物。再解离出产物或底物。 分为分为: 非中心复合物：酶未完全被底物饱和非中心复合物：酶未完全被底物饱和 中心复合物：中心复合物： 酶已经完全被底物饱和，酶已经完全被底物饱和， (EAB EPQ); (EA EP) 酶促反应动力学-多底物动力学3 (二二) 反应机制的分类和命名反应机制的分类和命名 (以双底物双产物反应为例）：以双底物双产物反应为例）： 1. 序列序列(sequential)反应机制反应机制: 酶必需与所有底物都结合之后才有产物放出。对于双酶必需与所有底物都结合之后才有产物放出。对于双 底物双产物反应，必有酶底物双

4、产物反应，必有酶-底物三元复合物形成。底物三元复合物形成。 根据底物及产物与酶的结合及释放是否有序分为根据底物及产物与酶的结合及释放是否有序分为: (1) 有序双双双底物双产物反应有序双双双底物双产物反应(ordered Bi Bi) ： A B P Q E EA (EABEPQ) EQ E EA、EQ : 非中心复合物；非中心复合物； (EAB EPQ) : 中心复合物中心复合物 A：领先底物；：领先底物； B：随后底物：随后底物 酶促反应动力学-多底物动力学4 例如：许多以例如：许多以NAD+或或NADP+为辅酶的脱氢酶类，为辅酶的脱氢酶类， 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDH)、苹果酸脱氢酶

5、、苹果酸脱氢酶(MDH)等等 NAD+ 苹果酸苹果酸(MA) 草酰乙酸草酰乙酸(OAA) NADH MA OAA E ENAD+ (ENAD+ E NADH) E NADH E NAD+ / NADH 形成形成外底物对外底物对 机制：由于底物机制：由于底物A与酶结合后改变了酶的构象，使与酶结合后改变了酶的构象，使 原来隐蔽的原来隐蔽的B结合位点暴露，结合位点暴露， B才能结合上去。才能结合上去。 暗示：暗示：A与与B可能结合在酶的不同部位。可能结合在酶的不同部位。 酶促反应动力学-多底物动力学5 (2) Theorell- Chance (T-C 机制机制)： A B P Q E EA EQ

6、E 第二个底物第二个底物B结合及释放非常快，没有明显的三元复合结合及释放非常快，没有明显的三元复合 物变构过程。可看作是三元复合物浓度极低的序列有序机制。物变构过程。可看作是三元复合物浓度极低的序列有序机制。 例如：马肝醇脱氢酶：例如：马肝醇脱氢酶： NAD+ 乙醇乙醇 乙醛乙醛 NADH E ENAD+ E NADH E 酶促反应动力学-多底物动力学6 (3)随机双双随机双双(random Bi Bi)： A B P Q EA EQ E （EABEPQ） E B A Q P 产物从酶上的释放及底物和酶的结合无一定顺序。产物从酶上的释放及底物和酶的结合无一定顺序。 少数脱氢酶和一些磷酸激酶属于

7、该类，例如肌酸激少数脱氢酶和一些磷酸激酶属于该类，例如肌酸激 酶酶: 肌酸肌酸 + ATP 磷酸肌酸磷酸肌酸+ ADP 机制：酶蛋白上的机制：酶蛋白上的A、B结合位均处于暴露状态，结合位均处于暴露状态， 两者与底物的结合即互不干扰，也不互相依赖。两者与底物的结合即互不干扰，也不互相依赖。 EBEP 酶促反应动力学-多底物动力学7 2 乒乓机制乒乓机制(Ping-Pang Bi Bi)： 各种底物全部和酶结合以前各种底物全部和酶结合以前 ，已经有一种或多种，已经有一种或多种 底物放出，不形成三元复合物。底物放出，不形成三元复合物。 A P B Q E (EAFP) F (FBEQ) E 属于该机

8、制的酶大多数具有辅酶，如转氨酶、黄素属于该机制的酶大多数具有辅酶，如转氨酶、黄素 酶等。谷草转氨酶属于典型的乒乓机制：酶等。谷草转氨酶属于典型的乒乓机制： Asp OAA AKG Glu ECHO (ECHOAsp ENH2 (ENH2AKG ECHO ENH2OAA) ECHOGlu) 酶促反应动力学-多底物动力学8 总结：总结： 有序机制有序机制 序列反应机制序列反应机制 T-C 机制机制 随机机制随机机制 乒乓反应机制乒乓反应机制 酶促反应动力学-多底物动力学9 二二 King-Altman法法速度方程图示法速度方程图示法 (一一)Kappa表示法表示法: E + A k1 EA 1 k

9、-1 2 Vf= k1 A E ; Vr= k-1 EA Kappa()= 速度常数项速度常数项 底物底物(产物产物)浓度项浓度项 正向反应的正向反应的Kappa：12 =k1 A 逆向反应的逆向反应的Kappa：21 =k-1 反应速度：反应速度：Vf= 12 E ; Vr= 21 EA 具有方向性，是一个矢量。其方向与酶形式的具有方向性，是一个矢量。其方向与酶形式的 流向有关流向有关 酶促反应动力学-多底物动力学10 (二二)King-Altman 法步骤法步骤: (1)首先写出反应历程，然后将反应历程安排成封首先写出反应历程，然后将反应历程安排成封 闭环形式。环的角数就是酶存在形式数目，

10、用闭环形式。环的角数就是酶存在形式数目，用n表表 示。然后在各角之间连线上标出各步反应的示。然后在各角之间连线上标出各步反应的。 E + A k1 EA k2 EP k3 E + P k-1 k-2 k-3 E k1A EA k-1 k-3P k3 k2 k-2 EP 酶促反应动力学-多底物动力学11 E = k-1k3 + k-1k-2 + k2k3 EA= k1k3 A + k1k-2A + k-2k-3P EP = k-1k-3P + k1k2A + k2k-3P E k1A EA k-3P k3 k-1 k2 k-2 EP E : EA: EP: （2）画出画出King-Altman

11、图形，即：所有流向各种酶形式的图形，即：所有流向各种酶形式的n1 线矢量图，再将各步反应的线矢量图，再将各步反应的标到矢量图上标到矢量图上, ,并并写出流向写出流向 各种酶形式的各种酶形式的乘积之和。乘积之和。 k-1 k3 k-2 k-1 k3 k2 k1A k3 k1A k-2 k-3P k-2 k-3P k-1 k1A k2 k-3P k2 酶促反应动力学-多底物动力学12 （3）速度方程推导）速度方程推导: 各种酶形式的浓度与其各种酶形式的浓度与其乘积之和成正比乘积之和成正比: E E ; EA EA; EP EP E0 = E + EA + EP E = E E0 E = （E）E0

12、 EA = EA E0 EA=（EA）E0 EP = EP E0 EP=（EP）E0 酶促反应动力学-多底物动力学13 V = k3 EPk-3 E P = (k3EP / k-3 PE/ )E0 = (k1k2k3 A k-1k-2 k-3 P ) E0 (k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+ k3)A+k-3 (k-1+ k-2+k2)P = num1A num2P const + coefA A + coefP P num1 : 分子中 分子中A项之前的系数乘以项之前的系数乘以E0 num2 : 分子中分子中P项之前的系数乘以项之前的系数乘以E0 const : 分

13、母常数项分母常数项 coefA : 分母中分母中A项之前的系数项之前的系数 coefP : 分母中分母中P项之前的系数项之前的系数 E k1A EA k-3P k3 k-1 k2 k-2 EP 酶促反应动力学-多底物动力学14 (三三) 注意注意: 矢量图数目的计算矢量图数目的计算 : n-1线矢量图数目线矢量图数目= m! (n-1)!(m-n+1)! n=角数角数; m=封闭环的线数封闭环的线数 n=3; m=3; n-1线矢量图数目线矢量图数目= 3! =3 (3-1)!(3-3+1)! 酶促反应动力学-多底物动力学15 King- Altman 图形不包含封闭环形式：图形不包含封闭环形

14、式： E1 E2 E3 E4 n=4，m=5 n-1线（线（3线）图数目线）图数目= 5！ ！ =10个， 个， (4-1)！ ！(5-4+1)！ 2个封闭环形式无效，应去除。共有个封闭环形式无效，应去除。共有8个有效的个有效的 King- Altman 图形图形 酶促反应动力学-多底物动力学16 反应历程中有时可能没有逆反应，此时有些反应历程中有时可能没有逆反应，此时有些 King- Altman 图形不存在。图形不存在。 E + A k1 EA k2 EP k3 E + P k-1 k-2 此反应若没有此反应若没有k-3 线，则某些线，则某些King-Altman 图形不图形不 存在，反应

15、速度中凡是含存在，反应速度中凡是含k-3 项项 者不存在。者不存在。 K-3 酶促反应动力学-多底物动力学17 E : k-1 k-1 k3 k3 k-2 k2 EA: k1A k1A k3 k-2 k-3P k-2 EP: k-1 k1A k-3P k2 k-3P k2 E = k-1k3 + k-1k-2 + k2k3 EA= k1k3 A + k1k-2A + k-2k-3P EP = k-1k-3P + k1k2A + k2k-3P E k1A EA k-3P k3 k-1 k2 k-2 EP 酶促反应动力学-多底物动力学18 V = k3 EPk-3 E P = (k1k2k3 A

16、k-1k-2 k-3 P ) E0 (k-1k3+k-1k-2+k2k3)+k1(k2+k-2+ k3)A+k-3 (k-1+ k-2+k2)P = num1A num2P const + coefA A + coefP P 酶促反应动力学-多底物动力学19 三三 双底物反应动力学双底物反应动力学 (一一) 有序双双机制：有序双双机制： 1 方程的推导：方程的推导： E + A k1 EA + B k2 (EABEPQ) k3 EQ + P k-1 k-2 k-3 k-4 k4 E + Q E k1A EA k-1 k4 k-4Q k-2 k2B k-3P EQ (EABEPQ) k3 酶促反

17、应动力学-多底物动力学20 n=4, m=4, 则则n-1线线(3线线)矢量图数目为矢量图数目为4 E : EA: EAB: EQ: k4 k1A k-3P k-1 k1A k-4Qk-4Q k-3Pk-3P k2B k2B k2B k-3P k-1k-1k-1 k4 k4 k4 k3k3 k2B k-2 k-2 k-1k-1k1A k-4Qk-4Qk-4Q k3 k3k3 k2B k2B k-2 k1Ak1Ak1A k4 k4 k-4Q k-3Pk-3P k3 k-2 k-2 k-2 酶促反应动力学-多底物动力学21 V=k4EQ k-4EQ =(k4EQ k-4QE) E0 = num1A

18、B - num2PQ const + coefA A + coefBB + coefPP + coefQQ + coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ +coefPQPQ + coefABPABP +coefBPQBPQ 若不考虑产物的影响，即若不考虑产物的影响，即 P=0, Q=0 初速度初速度V= num1AB const + coefAA + coefBB + coefABAB 酶促反应动力学-多底物动力学22 2 动力学常数的定义：动力学常数的定义： 最大反应速度：最大反应速度： 正向：正向：Vmf= num1 逆向：逆向：Vmr= num2 coefAB coefAB

19、米氏常数：米氏常数： KmA= coefB KmB= coefA coefAB coefAB KmP= coefQ KmQ= coefP coefPQ coefPQ 解离常数：解离常数：KiA = const K iB = const coefA coefB KiP = const K iQ = const coefP coefQ 酶促反应动力学-多底物动力学23 V = num1AB const + coefAA + coefBB + coefABAB = num1ABcoefAB const coefA + coefA A + coefB B + coefAB AB coefA coefA

20、B coefAB coefAB coefAB V = VmfAB KiA KmB + KmBA + KmAB + AB 双底物反应中米氏常数的意义： 双底物反应中米氏常数的意义： KmA： ：是 是B饱和时酶对底物饱和时酶对底物A的米氏常数的米氏常数 KmB： ：是 是A饱和时酶对底物饱和时酶对底物B的米氏常数的米氏常数 酶促反应动力学-多底物动力学24 3 有序机制动力学常数的求取有序机制动力学常数的求取(二次作图法二次作图法)： 第一次为双倒数作图，一般固定其中一个底物的浓度，变化第一次为双倒数作图，一般固定其中一个底物的浓度，变化 另一个（例如：固定另一个（例如：固定B，变化，变化A）。

21、将有序机制的动力学）。将有序机制的动力学 方程进行双倒数处理：方程进行双倒数处理： 1 = KmA ( 1+ KmBKiA ) 1 + 1 (1+ KmB) V Vm KmAB A Vm B 若将若将B固定于不同的浓度，则以固定于不同的浓度，则以 1/V 1/A 作图可得一组相交于第二 作图可得一组相交于第二 或第三象限的直线，其交点座标为：或第三象限的直线，其交点座标为： - 1 1 ( 1- KmA ) KiA , Vm KiA 1/V 1/A B1 B2 B3 纵截距为：纵截距为： 1 ( 1+ KmB ) Vm B 酶促反应动力学-多底物动力学25 第二次作图：纵截距第二次作图：纵截距

22、1/B作图作图 由第二次的作图可知由第二次的作图可知 KmB和和Vm, 代入交点坐标中可知代入交点坐标中可知KmA 若若A (A饱和时饱和时)： 1 = 1 (1 + KmB ) V Vm B 转化为米氏方程转化为米氏方程 若若B (B饱和时饱和时): 1 = 1 (1 + KmA ) V Vm A 这就是水解反应可看作是单底物反应的原因，因为另一底物这就是水解反应可看作是单底物反应的原因，因为另一底物 是水，其浓度可看作是饱和。是水，其浓度可看作是饱和。 纵截距纵截距 ： 1 ( 1+ KmB ) Vm B 1/B 1/Vm - 1 KmB 酶促反应动力学-多底物动力学26 (二二) 随机双

23、双：随机双双： 1 动力学方程推导：动力学方程推导： m=8, n=6, n-1=5线图：线图：56个个 封闭环：封闭环：24个个 有效图形：有效图形：32个个 EA EB EP EQ E(EABEPQ) 酶促反应动力学-多底物动力学27 假设反应过程第一个底物与酶结合或第一个产物从酶假设反应过程第一个底物与酶结合或第一个产物从酶 释放是迅速平衡过程释放是迅速平衡过程迅速平衡随机双双迅速平衡随机双双: V= num1AB - num2PQ const + coefA A + coefBB + coefPP + coefQQ + coefABAB+coefPQPQ 若若P=0 Q=0 则则 :

24、V = num1AB const + coefA A + coefBB + coefABAB V = VmfAB KiA KmB + KmBA + KmAB + AB 此方程与有序机制相同，称为序列机制的总方程。此方程与有序机制相同，称为序列机制的总方程。 酶促反应动力学-多底物动力学28 (三三) 乒乓双双机制：乒乓双双机制： 1 速度方程速度方程: 乒乓机制的乒乓机制的King-Altman环形表达式为：环形表达式为： E k1A (EAFP) k-1 k4 k-4Q k2 k-2P (EQFB) k-3 F k3B m=4 n=4，每种酶都有，每种酶都有4种种3线图。线图。 酶促反应动力学-多底物动力学29 V= num1AB - num2PQ coefA A + coefBB + coefPP + coefQQ + coefABAB+coefAPAP+coefBQBQ+ coefPQPQ 若不计产物影响，若不计产物影响，P=0 Q=0，则：，则： V= num1AB coefA A + c