基因克隆载体

1、基因克隆载体基因克隆载体 一、概念一、概念 克隆载体是一种能够携带外源DNA片段或基因进入受体细胞，并 使其在受体细胞得以维持或表达的DNADNA分子分子。 载体的功能载体的功能： 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 二、基因克隆载体必须具备的条件二、基因克隆载体必须具备的条件 1、容易进入宿主细胞容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。 2、能携带外源DNA片段进入受体细胞自我复制自我复制，或整入染 色体随受体细胞DNA复制而复制。 3、自身分子质量较小分子质量较小，拷贝数高。 4、必须带有标记基因标记基因，以便重组后进行重组

2、子的筛选。 5、安全性安全性。不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其 人的细胞。 随着分子生物学技术的发展,越来越多的克隆载体 相继出现 ,这些载体的发展推动了结构基因组学和 功能基因组学研究。同时随着人类基因组计划和植 物基因组计划的实施 ,克隆载体的整体结构、克隆 能力和转化效率等都有了长足的发展。可以把克隆可以把克隆 载体的发展划分为三个阶段载体的发展划分为三个阶段 : 三、基因克隆载体的发展阶段三、基因克隆载体的发展阶段 第一阶段以质粒质粒、噬菌体、柯斯质粒噬菌体、柯斯质粒为主,主要特点是 载体在宿主细胞内稳定遗传、易分离、转化效率高 ,但 是克隆容量有限 ,一般小于 45kb 。

3、第二阶段的克隆载体则突破了上述载体容量,显著特点是 载体的容载能力扩大,约100350kb ,主要有酵母人工染酵母人工染 色体色体、细菌人工染色体细菌人工染色体、以及源于噬菌体以及源于噬菌体 P1 P1的人工染色的人工染色 体体。 第三个发展阶段是以近几年发展起来的双元细菌人工染双元细菌人工染 色体色体(BIBAC)(BIBAC)和可转化人工染色体和可转化人工染色体(TAC)(TAC),这些载体不仅具 有较大的克隆容量 ,而且具备了直接转化植物进行功能 互补实验的功能。 四、常用克隆载体四、常用克隆载体 质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 柯斯质粒载体柯斯质粒载体 人工染色体载体人工染色体

4、载体 大片段双元载体大片段双元载体 1 1、质粒载体、质粒载体 （1 1） 生物学特征生物学特征: : 质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色 体以外的能自主的复制的裸露的环状双 链DNA分子，比病毒更简单。目前对大 肠杆菌的质粒研究得比较深入。质粒的 大小差异很大，最小的只有1kb,只能编 码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大 的达到200kb。 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进 行自主复制根据在每个细胞中的分子数 （拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制 类型： 严紧型质粒严紧型质粒 1 - 3 拷贝 松弛型质粒松弛型质粒 10 - 60 拷贝 （2 2）质粒的不亲和性：）质粒的不亲和性： 任何

5、两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一 个细胞中。 亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒。 不亲和性（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒 意义：受体细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性 质粒，最好不含内源性质粒。 （3 3）质粒的可转移性：质粒的可转移性： 是指在自然条件下，质粒 可以通过细菌的接合作用 转移到新宿主内，根据质 粒的转移性，将质粒分为： 接合型质粒：能在天然条 件下自发地从一个细胞转 移到另一个细胞，如F、 Col、R质粒等。 非接合型质粒：不能在天 然条件下独立地发生接合 作用。 （4 4）迁移作用）迁移作用 某些非接合型质粒非接合型质粒（Co

6、lE1）在接合型质粒的存在和协助下，发 生DNA转移的过程。 （5 5）携带特殊的遗传标记）携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得 寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，这些标记基因对DNA 重组分子的筛选具有重要意义。 （6 6）质粒的构建：）质粒的构建： 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往 往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 构建原则构建原则 ： 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、 克隆位点、启动子和终止子 2、正确获得构建质粒克隆载体的元

7、件 3、组装合适的选择标记基因 4、选用合适的启动子 5、构建过程力求简单 （7 7）重要的大肠杆菌质粒载体：）重要的大肠杆菌质粒载体： pBR322pBR322质粒载体：质粒载体： （1）较小的分子量较小的分子量，pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的 外源DNA。 （2）带有一个复制起始位点带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细 胞中行使复制的功能。 （3）较高的拷贝数较高的拷贝数，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方 便。 （4）具有两种抗菌素抗性基因两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择标记。 pUCpUC质粒载体：质粒载体： （1）分子量更小、拷贝数更高。分子量

8、更小、拷贝数更高。 （2）免疫组化法免疫组化法一步实现筛选鉴定重组体，省时。 （3）装有多克隆位点（多克隆位点（MCSMCS），方便转移外源DNA在不同载体系列 中穿梭，使具有两种不同粘末端的外源DNA能直接克隆入pUC载体。 （4）选择颜色标记选择颜色标记 lacZlacZ，用于基因克隆和测序。 2 2、噬菌体载体、噬菌体载体 （1 1）定义）定义 噬菌体是病毒病毒的一种，其DNA能被开发 成为基因工程的有用载体，高效的感 染性能使外源基因高效导入受体细胞， 自主复制繁殖性能使外源基因在受体 细胞中高效扩增。 噬菌体主主要有双链噬菌体双链噬菌体和单链丝单链丝 状噬菌体状噬菌体两大类。 重组D

9、NA技术中常 用的噬菌体克隆载体主要有双链的 类噬菌体类噬菌体和单链的M13M13噬菌体噬菌体。 （2 2）噬菌体的生长周期：溶菌周期、溶源周期）噬菌体的生长周期：溶菌周期、溶源周期 溶菌周期溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行 自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主 细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。只有溶菌生长周期的噬 菌体被称为烈性噬菌体烈性噬菌体。 在溶源周期溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞 染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。并不产生子 代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态溶原状态。 DNADNA重组技术一般需要噬菌体进入

10、溶菌状态。只有溶源周期的重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态。只有溶源周期的 噬菌体被称为温和噬菌体噬菌体被称为温和噬菌体。 （3 3） 噬菌体噬菌体 生物学特征生物学特征 DNA为线状双链DNA分子，在分子两端 各有12个碱基的单链互补粘性末端。当 其注入到寄主细胞中后，可以迅速通过 这两个粘性末端的互补作用形成双链的 环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形 成的双链区被称为coscos位点位点。 噬菌体构建的基本策略噬菌体构建的基本策略: : 切去部分非必需区 删掉多余的限制性内切酶位点 插入选择性标记基因 建立体外包装系统 噬菌体噬菌体DNADNA作为载体的优点：作为载体的优点： DNA在

11、体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 DNA载体的装载能力为25 kb，远大于质粒的装载量 重组DNA分子的筛选较为方便 重组DNA分子的提取较为简便 DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因 噬菌体克隆载体的应用噬菌体克隆载体的应用 建立建立cDNAcDNA基因文库基因文库：转导转导(transduction)由噬菌体和细胞病毒介导的遗 传信息转移过程。效率高。转染转染(transfection) 指真核细胞主动或者 被动导入外源DNA 片段而获得新表型的过程。 克隆外源目的基因克隆外源目的基因 （4 4） M13M13噬菌体噬菌体: : M13噬菌体颗粒的外形呈丝状

12、，在颗粒中包装的仅是（十）链（十）链的 DNA，有时亦称为感染性的单链感染性的单链。 M13 M13载体的优点载体的优点： M13载体系列特别适用于克隆单链的适用于克隆单链的DNADNA分子分子。 在这类载体的基因组中有一条饰变的半乳糖苷酶基因片段 （Hindll片段）,其中插入了一段具有密集的多克隆位点密集的多克隆位点的序列。 M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的，可以有效地克有效地克 隆双链隆双链DNADNA分子中的每一条链分子中的每一条链。 噬菌粒载体：噬菌粒载体： 针对M13M13噬菌体的局限性噬菌体的局限性发展的一类由质粒载体和单链噬菌体结 合而成的新型载体-噬菌粒。常用噬菌

13、粒载体有pUCll8pUCll8和和 pUCll9pUCll9噬菌粒载体噬菌粒载体是一对分别由pUC18和pUC19质粒与野生型M13 噬菌体的基因间隔区（IG）重组而成的噬菌粒载体。 噬菌粒载体的特点：噬菌粒载体的特点： 能像M13-DNA那样体外包装体外包装，并高效高效转染受体细胞 能像质粒那样在受体细胞中自主复制自主复制 装载量装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb） 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA 重组操作简便操作简便，筛选容易 3 3、柯斯质粒载体、柯斯质粒载体 （1 1）定义：）定义： 柯斯质粒是一类人工构建人工构建的含有 DNADNA的的coscos序

14、列序列和质粒复制子质粒复制子的特殊 类型的质粒载体。 柯斯质粒的大小为4-6kb，由3部分 组成： A.多克隆位点区 B.含有cos位点的DNA区 C.复制起始位点和抗性标记区 （2 2）柯斯质粒载体的特点：）柯斯质粒载体的特点： 1、具有具有 噬菌体的特性噬菌体的特性。柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后 可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入 寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒， 也不能发生溶菌现象。 2、具有质粒载体的特性具有质粒载体的特性。能象质粒一样在寄主细胞内复制，且 带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点， 为重组体的筛选提

15、供了方便。 3、高容量的克隆能力cos质粒本身很小，只有复制起点、选择 标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达克隆上限可达45kb45kb左右左右。不过由 于包装的限制，其克隆片段至少要达到克隆片段至少要达到30kb30kb。 （3 3）柯斯克隆：）柯斯克隆： 应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组 DNA技术，叫做“柯斯克隆”（cosmid cloning）。 这种技术的理论依据是，在线性噬菌体DN分子的每一端，都 具有一段彼此互补的单链突出序列，即所谓的粘性末端（cos位 点）。在噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个DNA 拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后

16、两个DNA基因组 之间都是通过cos位点连接起来的。噬菌体具有的一种位点特 异的切割体系，叫做末端酶（terminase）或Ter体系，能识别两 个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成单位长度的片段， 并将它们包装到噬菌体头部中去。只有在被作用的DNA分子 具有两个cos位点，而且它们之间的距离保持在3854kb的条件 下，Ter体系才能对它们发生作用。 （4 4）柯斯质粒载体的适用范围：）柯斯质粒载体的适用范围： 柯斯质粒载体一般只在以下两种特定情况特定情况适用： 在单个重组体中克隆和增值完整的真核基因； 克隆和分析某一基因家族的真核DNA片段，即载体克隆的容量 大且具有明显优势时使用。

17、 4 4、人工构建载体、人工构建载体 （1 1）定义：）定义： 将细菌接合因子或酵母菌染色体细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与 质粒质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克 隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然 染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传在受体细胞中稳定的复制并遗传。目前常用的人造 染色体载体包括： 细菌人造染色体（细菌人造染色体（BACBAC） 酵母人造染色体（酵母人造染色体（YACYAC） P1派生人工染色体（PAC） 哺乳动物人工染色体（MAC） 人类游离人工染色体（HAEC） （2 2）人工染色体的制备原理：）人工

18、染色体的制备原理： 天然染色体基本功能单位包括复制起始点、着丝粒和端粒 (telomere)。复制起始点，保证了染色体复制，着丝粒保证了染 色体分离，端粒封闭了染色体末端，防止粘附到其他断裂端，保 证了染色体的稳定存在。 人们为了克隆大片段DNA，利用DNA体外重组技术分离了天然染色 体的基本功能元件并将它们连接起来，从而构成了人工染色体。 相比于其他复制子而言，染色体要大得多。 （4 4）酵母人造染色体）酵母人造染色体 （YACYAC） 酵母人工染色体（YAC)是 人工染色体中能克隆最大 DNA片段的载体，可以插入 人工染色体100-2000kb的 外源DNA片段。YAC是有酵酵 母母的自主

19、复制序列、着丝 点、四膜虫四膜虫的端粒以及酵酵 母选择性标记母选择性标记组成的酵母 线性克隆载体。 酵母人造染色体（酵母人造染色体（YACYAC）优点：优点： 可以容纳更长的DNA片段，用较少的克隆较少的克隆就可以包含特定的基因 组全部序列，从而保持了基因组特定序列的完整性保持了基因组特定序列的完整性，有利于物理 图谱的制作。 酵母人造染色体（酵母人造染色体（YACYAC）缺点：缺点： 克隆外源基因易出现嵌合体。 有些克隆不稳定。 YAC克隆不容易与酵母自身染色体相分离。 应用领域：应用领域： 在染色体区带构建YAC重叠群，可以促进大规模基因组测序和致 病基因的克隆。 （3 3）细菌人造染色体

20、（）细菌人造染色体（BACBAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆大肠杆 菌性因子菌性因子F F质粒质粒的基础上构建的， 其装载量范围在50-300 kb之间。 pBACs主要适用于：克隆大型基因 簇、构建动植物基因文库 BAC BAC 优点优点 : : 以大肠杆菌为寄主以大肠杆菌为寄主, ,转化率高转化率高,构建BAC文库比YAC文库更容易 ; BACBAC载体以环型超螺旋状态存在载体以环型超螺旋状态存在, ,从大肠杆菌中提取质粒较方便从大肠杆菌中提取质粒较方便, 而从酵母中分离 DNA 较困难 ; BAC的复制子来源于F因子,可稳定遗传可稳定遗传, ,嵌合及重组现象少嵌合及重组现象少 ; 可

21、以通过菌落原位杂交来筛选目的基因,方便快捷方便快捷 ; BAC 载体在克隆位点的两侧具有T7和Sp6聚合酶启动子 ,可以用 于转录获得RNA探针或直接用于插入片段的末端测序。 YAC、BAC载体不能直接进行植物转化,在候选克隆的转化互补实 验中需要将外源片段进行亚克隆,因而工作量大,同时也有漏失目 的DNA片段的可能。因此,可直接用于植物转化的大片段双元载体直接用于植物转化的大片段双元载体 便应运而生,具有代表性的载体系统有BIBAC和TAC。 5 5、大片段双元载体、大片段双元载体 （1 1）双元细菌人工染色体双元细菌人工染色体( BIBAC)( BIBAC) 结合BACBAC载体载体和TiTi质粒质粒的特点,构建了双元BAC载体BIBAC2,该载体 在结构上具有BAC的复制系统,又加入在农杆菌中起作用的Ri复制 子和抗卡那霉素筛选标记及T2DNA的左右边界,因此BIBAC能在大能在大 肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭复制肠杆菌和根癌农杆菌中穿梭复制。 （2 2）P1P1克隆系统和源于克隆系统和源于P1P1的人工染色体的人工染色体(PAC)(PAC) PAC载体以F F因子因子和噬菌体噬菌体P1P1为基础构建,兼有二者的特点,通过电 激穿孔转化可将PAC导入大肠杆菌。其特点是插入的外源插入的外源DNADNA没有没有 明显的嵌合和缺失现象明显的嵌合和缺失现象,PAC载体可以插入约