硼酸滴耳液微生物限度检查方法学验证

1、 硼酸滴耳液微生物限度检查方法学验证 摘要：目的 建立医院制剂硼酸滴耳液的微生物限度检验方法。方法 按中国药典2015年版四部微生物限度检查法规定，采用平皿法对云南省保山市人民医院3个批次的硼酸滴耳液进行微生物限度检查方法适用性试验。结果 本研究建立的检查方法对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉五种验证菌株的回收率均在0.52；控制菌试验组、阳性对照组都为阳性，供试品对照组、阴性菌对照组、阴性对照组为阴性，试验结果有效。结论 硼酸滴耳液进行微生物限度检查时，可取供试品1:10,1:100的稀释液，采用平皿法检查需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数；控制菌采用常规法。可有效的

2、反映药物中微生物的污染情况。关键词 :硼酸滴耳液；微生物限度；验证；常规法verification of microbial limit test methodology for boric acid ear dropsabstract: objective to establish a microbial limit test method for boric acid ear drops from hospital preparations. methods according to the four microbial limit test methods of chinese phar

3、macopoeia (2015 edition), the applicability of microbial limit test method for 3 batches of boric acid ear drops from baoshan peoples hospital of yunnan province was tested by plate method. results the recoveries of staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa, bacillus subtilis, candida albicans a

4、nd aspergillus niger were 0.5-2. the control bacteria test group and the positive control group were positive, while the test product control group, the negative bacteria control group and the negative control group were negative, and the test result was effective. conclusion when boric acid ear dro

5、ps were used for microbial limit test, diluents of 1:10 and 1:100 samples were recommended. the total number of aerobic bacteria, molds and yeasts was detected by plate method. routine methods were used to control the bacteria. it can effectively reflect the contamination of microorganisms in drugs.

6、key words: boric acid ear drops; microbial limits; validation; the conventional method引言硼酸滴耳液广泛用于治疗慢性中耳炎，具有防腐消毒作用。中国药典2015年版四部规定，供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判定供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认1。为此，对硼酸滴耳液微生物限度检查方法进行适用性试验。1 实验材料1.1 供试品硼酸滴耳液（保山市人民医院制剂室，规格：8ml/瓶，批号：20200622,20201119,2020

7、1215）1.2 培养基及稀释剂胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：190606)；沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号：190428)；胰酪大豆胨液体培养基(批号：1906142)；甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号：181024)；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号：180926)，均为北京三药科技开发公司生产，经过培养基的适用性检查，结果符合药典要求。1.3 菌种铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa)cmcc(b)10104、金黄色葡萄球菌（staph ylococcus aureus）cmcc（b）26003、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）cmcc（b）63501、白

8、色念珠菌（canidia albicans）cmcc（f）98001、黑曲霉（aspergillusniger）cmcc（f）98003，均来源于北京三药科技开发公司（中国食品药品检定研究院监制）。2方法与结果2.1菌液制备2.1.1储备液制备取西林瓶包装的定量菌株（含菌数约为1000-10000cfu）铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉分别加入1ml的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数约为1000-10000cfu的阳性对照储备菌液，备用。2.1.2阳性对照菌液制备取上述储备液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含菌数约为10-100cfu的阳性对照菌液，

9、备用。2.2供试液的制备分别从每个批次的两瓶样品中取10ml,加胰酪大豆胨液体培养基至100ml,震荡摇匀，制成1：10,1：100供试液，备用。2.3需氧菌总数计数方法的验证2.3.1试验组取1：10，1：100的供试品液各5支，每支9.9ml，分别加入铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉储备液0.1ml，混匀；分别取上述液各1ml注入平皿（每支2皿），倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，34.1培养三天后计数。2.3.2 菌液对照组取铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉对照菌液各1ml，分别注入平皿（每种菌2皿），倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，34.1

10、培养三天后计数。2.3.3供试品对照组取1：10，1：100的供试液各1ml分别注入平皿（每个稀释级2皿），倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，34.1培养三天后计数。2.4霉菌和酵母菌总数计数方法的验证2.4.1试验组取2.3.1制备好的白色念珠菌、黑曲霉试验组供试液各1ml分别注入平皿（每支2皿），倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，23.0培养五天，计数。2.4.2菌液对照组取白色念珠菌、黑曲霉对照菌液各1ml（每种菌2皿），倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，23.0培养五天，计数。2.4.3供试品对照组取1：10，1：100的供试液各1ml分别注入平皿（每个稀释级2皿），倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，23.0培养五天

11、，计数。2.5回收率的计算按如下公式计算试验组的回收率：回收率 =试验组菌落数-供试品对照组菌落数菌液对照组菌落数本研究建立的检查方法对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉五种验证菌的回收率均在0.52。见表1。表1 试验组菌回收率结果菌种批号202006222020111920201215菌液对照组试验组平均值回收率平均值回收率平均值回收率铜绿假单胞菌421：10320.76310.74390.931：100330.79270.64340.81金黄色葡萄球菌781：10921.18861.10630.811：100851.09670.86660.85枯草芽孢杆菌10

12、51：10690.66760.72720.691：100750.71840.80780.74白色念珠菌291：10331.14210.72260.901：100250.86230.79270.94黑曲霉361：10310.86250.69371.031：100350.97371.03280.70白色念珠菌（霉菌及酵母菌）401：10320.80431.08350.881：100290.73441.10360.90黑曲霉（霉菌及酵母菌）521：10380.73561.08430.831：100490.94500.96480.922.6控制菌检查方法验证根据2015版药典（四部）通则1107规定，

13、耳用制剂控制菌检查包括铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。2.6.1试验组取1：10的供试液10ml两份各加入100ml的胰酪大豆胨液体培养基中，分别加入铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌对照菌液1ml，34.1培养18h，取上述培养物分别划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上34.1培养18h，观察并记录。2.6.2阳性对照组不加供试液，其它操作同试验组，观察并记录。2.6.3阴性对照组以稀释剂替代供试液，不加菌液，其它操作同试验组，观察并记录。2.6.4阴性菌对照组以大肠埃希菌对照菌液1ml替换2.6.1的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌阳性对照菌，其它同法操作，观察并记录。

14、2.6.5供试品对照组不加对照菌液，其它操作同试验组，观察并记录。2.6.6验证结果采用常规法进行控制菌检查，阳性菌均检出，阴性对照未检出，阴性菌无干扰。本方法准确可行。见表2。表2控制菌检查方法适用性试验结果检测项目批号202006222020111920201215铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌供试品对照组-试验组+阴性菌对照组-阳性对照组+阴性对照组-3 讨论随着我国对药品质量标准要求的不断提高，根据新版药典的规定，药品都应建立与其相适应的微生物限度检查方法。医院制剂虽成分较为简单，但依旧存在各种影响微生物限度检查的因素。为确保微生物检验结果准确可靠，进行微生物限度检查方法适用性验证至关重要。2-3本研究根据2015版中国药典四部微生物限度检查法对云南省保山市人民医院生产的硼酸滴耳液进行微生物限度检查，并对其检验方法进行适用性试验，结果证明可取供试品1:10,1:100的稀释液，采用平皿法检查需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数；控