代谢所常用实验技术-聂宏光

1、代谢病研究常用实验技术代谢病研究常用实验技术 聂宏光聂宏光 教授教授 常用实验技术简介常用实验技术简介 样品中维生素样品中维生素D的含量测定的含量测定 无创血压测量系统无创血压测量系统 实时定量实时定量PCR技术技术 尤斯灌流室系统尤斯灌流室系统 膜片钳系统膜片钳系统 维生素维生素D D的含量测定的含量测定 维生素维生素D D简介简介 功能性维生素功能性维生素D D主要包括主要包括D3D3和维生素和维生素D2D2。维生。维生 素素D D除了具有传统意义上的骨骼效应，它还有着除了具有传统意义上的骨骼效应，它还有着 广泛的非骨骼效应，与心血管疾病，免疫疾病，广泛的非骨骼效应，与心血管疾病，免疫疾病

2、， 糖尿病，肿瘤等疾病密切相关。糖尿病，肿瘤等疾病密切相关。25-25-羟基维生素羟基维生素D D （25HD25HD）的测定是衡量维生素）的测定是衡量维生素D D营养状态的最佳营养状态的最佳 指标。指标。 根据测定原理不同，目前根据测定原理不同，目前25HD25HD的测定方法的测定方法有有: : 1.1. 放射免疫法放射免疫法(RIA)(RIA)灵敏度高、特异性强、精灵敏度高、特异性强、精 密度好、仪器设备条件要求不高。是基层单位密度好、仪器设备条件要求不高。是基层单位 对超微量物质测定的主要手段。但存在放射污对超微量物质测定的主要手段。但存在放射污 染的潜在风险。染的潜在风险。 2.2.

3、酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附实验 (ELISA)(ELISA)仪器设备操作仪器设备操作 简单无污染但灵敏度和特异性低。是目前实验简单无污染但灵敏度和特异性低。是目前实验 室较常用的检测方法。室较常用的检测方法。 3.3. 化学发光免疫测定化学发光免疫测定(CLIA)(CLIA)操作简单，快速操作简单，快速 且容易自动化，现已有多家厂商开发出相关自且容易自动化，现已有多家厂商开发出相关自 动免疫分析仪。动免疫分析仪。 25HD 25HD的测定方法的测定方法: : 4.4. 高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)(HPLC)灵敏度、特异性、准灵敏度、特异性、准 确性都较高，但设备较贵且标本前处理

4、过程复杂。确性都较高，但设备较贵且标本前处理过程复杂。 5.5. 液相色谱液相色谱- -质谱联用法质谱联用法(LC-MS/MS)(LC-MS/MS)灵敏度、灵敏度、 特异性、准确性都高但操作程序较复杂且需要更特异性、准确性都高但操作程序较复杂且需要更 昂贵的特殊仪器。昂贵的特殊仪器。 ELISAELISA法检测原理法检测原理 标准品、质控品和样本被标记有标准品、质控品和样本被标记有2525羟基维生素羟基维生素D D 的生物素稀释。稀释后的样品在包被了高特异性羊的生物素稀释。稀释后的样品在包被了高特异性羊 2525羟基维生素羟基维生素D D抗体的微孔中室温孵育抗体的微孔中室温孵育2 2小时后，加

5、小时后，加 入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白并有选择的入辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白并有选择的 与复合生物素结合，再利用底物显色。利用酶标板与复合生物素结合，再利用底物显色。利用酶标板 读取读取吸光度吸光度，颜色强度，颜色强度与与2525羟基维生素羟基维生素D D浓度成反比浓度成反比。 维生素维生素D D的含量测定的含量测定 临床血液样品的制备与分组临床血液样品的制备与分组 血液中维生素血液中维生素D D的检测的检测：应用：应用2525羟基维生素羟基维生素D D酶酶 免疫试剂盒定量测定人体血清或血浆中的免疫试剂盒定量测定人体血清或血浆中的2525羟基羟基 维生素维生素D D和其他羟基化的

6、代谢产物和其他羟基化的代谢产物 检测结果的分析方法检测结果的分析方法 临床血液样品的制备临床血液样品的制备 n全血样品采集完毕待自然凝固后放置全血样品采集完毕待自然凝固后放置4 488环境环境 中过夜，中过夜，80008000转转离心离心4 4分钟，取上清液置于新离分钟，取上清液置于新离 心管内。心管内。 n合格血清标准合格血清标准 血清质量性状要求血清质量性状要求外观清亮流动性较好外观清亮流动性较好。血清。血清 应未腐败（新鲜）、无溶血、透明（无明显沉淀应未腐败（新鲜）、无溶血、透明（无明显沉淀 物）、无杂质、未凝固或未完全凝固、体积足够物）、无杂质、未凝固或未完全凝固、体积足够 检测与样品

7、备份。检测与样品备份。 血液中维生素血液中维生素D D的检测的检测 检测结果的分析方法检测结果的分析方法 绘制标准曲线：在半对数坐标纸上做出一条校绘制标准曲线：在半对数坐标纸上做出一条校 准曲线（以准曲线（以B/B0%B/B0%为纵坐标，为纵坐标，25-OH-VitD25-OH-VitD浓度为横坐浓度为横坐 标）。每个待测样本都计算标）。每个待测样本都计算B/B0%B/B0%并且读数，在标准并且读数，在标准 曲线上找对应的曲线上找对应的25-OH-VitD25-OH-VitD浓度值。浓度值。 无创血压测量系统无创血压测量系统 无创血压测量系统的操作方法无创血压测量系统的操作方法 动物血压采集原

8、理动物血压采集原理 鼠模型的确立与分组鼠模型的确立与分组 血压采集器的操作血压采集器的操作 采集数据的分析采集数据的分析 传统的血压计传统的血压计测量小动物血压：测量小动物血压： 被测量的小鼠无法适应造成血压值不具有代表性；被测量的小鼠无法适应造成血压值不具有代表性； 血压产生的振动波微弱很难检测到或是夹杂噪音；血压产生的振动波微弱很难检测到或是夹杂噪音； 小鼠在测量过程中骚动破坏了测量过程。小鼠在测量过程中骚动破坏了测量过程。 无创血压测量系统简介无创血压测量系统简介 无创血压测量装置和系统无创血压测量装置和系统用于慢性实验中动物用于慢性实验中动物 动脉血压的观测动脉血压的观测, , 动物不

9、需麻醉、无创伤、使用动物不需麻醉、无创伤、使用 方便。采用国际上流行的方便。采用国际上流行的尾袖法尾袖法无创测量血压原无创测量血压原 理，适用的动物包括大、小白鼠、猫和狗等。理，适用的动物包括大、小白鼠、猫和狗等。 无创血压测量系统测量原理无创血压测量系统测量原理 与人体手臂血压测量方法相似。即通过对动物与人体手臂血压测量方法相似。即通过对动物 肢体或尾部加压，阻断其血压，以不能记录肢体肢体或尾部加压，阻断其血压，以不能记录肢体 或尾部脉搏为准；然后逐渐减压，当尾部重新出或尾部脉搏为准；然后逐渐减压，当尾部重新出 现脉搏波时（即内外压相等时）获得动物的现脉搏波时（即内外压相等时）获得动物的收缩

10、收缩 压压；继续减压，直至脉搏波逐渐增至最大，得到；继续减压，直至脉搏波逐渐增至最大，得到 动物的动物的舒张压舒张压。 无创血压测量系统特点无创血压测量系统特点 1 1）全自动的无创血压测量过程：系统自动充放气，）全自动的无创血压测量过程：系统自动充放气， 自动实时测量并存贮测量结果；自动实时测量并存贮测量结果； 2 2） 一次可同时测量一次可同时测量6 6只大鼠血压，大大提高了实只大鼠血压，大大提高了实 验人员的工作效率；验人员的工作效率； 3 3） 测量多项无创血压生理指标，包括：测量多项无创血压生理指标，包括：收缩压、收缩压、 舒张压、平均压、心率舒张压、平均压、心率等；等； 4 4）

11、方便的测量方式和测量数据的导出。方便的测量方式和测量数据的导出。 无创血压测量系统组成无创血压测量系统组成 该系统由通用该系统由通用8 8道生物机能实验系统、道生物机能实验系统、BP-6ABP-6A恒恒 温箱、鼠尾脉搏探测和阻断器、大鼠固定笼以及温箱、鼠尾脉搏探测和阻断器、大鼠固定笼以及 BP-6ABP-6A服务器构成。服务器构成。 8 8通道信号采集系统通道信号采集系统 通用通用8 8道生物机能实验系统不仅可以完成道生物机能实验系统不仅可以完成无创血无创血 压测量压测量功能，还可记录功能，还可记录其它生物信号其它生物信号，如张力、，如张力、 心电等，大大拓宽了该系统的适用范围。心电等，大大拓

12、宽了该系统的适用范围。 BP-6ABP-6A恒温箱恒温箱 为最多为最多6 6只大鼠同时提供只大鼠同时提供恒温环境恒温环境，同时减少实，同时减少实 验动物的外界干扰。该箱体内嵌微电脑控制系统，验动物的外界干扰。该箱体内嵌微电脑控制系统， 可以自动控制血压测量过程中的充放气，鼠尾脉搏可以自动控制血压测量过程中的充放气，鼠尾脉搏 信号的转接和传送等。信号的转接和传送等。 BP-6ABP-6A恒温箱控制面板。恒温箱控制面板。 鼠尾脉搏探测和阻断器鼠尾脉搏探测和阻断器 一体化鼠尾脉搏一体化鼠尾脉搏探测器探测器和鼠尾脉搏和鼠尾脉搏阻断器阻断器， 其中探测器用于获取鼠尾正常脉搏信号，而阻断其中探测器用于获取

13、鼠尾正常脉搏信号，而阻断 器用于阻断尾部正常脉搏信号。器用于阻断尾部正常脉搏信号。 BP-6ABP-6A系统的其它附件包括：大鼠固定器，系统的其它附件包括：大鼠固定器， USBUSB连线，信号连接线等。连线，信号连接线等。 无创血压测量系统操作步无创血压测量系统操作步骤（骤（1 1） 1. 1. 使用专门的连接线连接加热箱控制面板上的使用专门的连接线连接加热箱控制面板上的脉搏传感器脉搏传感器输出输出 口与动物无创血压采集系统口与动物无创血压采集系统8 8道系统；道系统； 2. 2. 将传感器上的接头插到对应机箱内的连接器接头上，将将传感器上的接头插到对应机箱内的连接器接头上，将进气进气 口口的

14、气管连接在机箱内对应的充气口接口上。的气管连接在机箱内对应的充气口接口上。 3. 3. 将动物血压测量系统通过将动物血压测量系统通过USBUSB连接线连接到连接线连接到电脑电脑上，打开软上，打开软 件，进入到软件界面。件，进入到软件界面。 4. 4. 打开打开BP-6ABP-6A的电源，系统开始进行加热，设定实验所需的加的电源，系统开始进行加热，设定实验所需的加 热温度，一般情况设置为热温度，一般情况设置为3636。 无创血压测量系统操作无创血压测量系统操作步骤（步骤（2 2） 5. 5. 将大鼠放入鼠笼内将大鼠放入鼠笼内固定固定（注意一定要保持大鼠腹壁向下），（注意一定要保持大鼠腹壁向下），

15、 固定好后将其整体放入加热箱内。固定好后将其整体放入加热箱内。 6. 6. 将大鼠将大鼠鼠尾穿过传感器鼠尾穿过传感器，并尽可能将传感器置于鼠尾根部。，并尽可能将传感器置于鼠尾根部。 7. 7. 在无创机箱后覆盖一层厚的深色窗帘，减小在无创机箱后覆盖一层厚的深色窗帘，减小光线光线对大鼠的对大鼠的 影响。影响。 8. 8. 从实验项目菜单中选择从实验项目菜单中选择“无创血压测量无创血压测量”命令，选择工具命令，选择工具 条上条上“启动实验启动实验”按钮，软件界面中即有信号出现按钮，软件界面中即有信号出现。 无创血压测量系统操作步骤无创血压测量系统操作步骤 9. 9. 实验开始后，老鼠需要实验开始后

16、，老鼠需要20min20min才能出现才能出现稳定稳定波形。波形。 10. 10. 待出现稳定的脉搏波后，按下机箱控制面板上的待出现稳定的脉搏波后，按下机箱控制面板上的“启启/ /停停” 键，系统开始按照设定的参数对大鼠尾部血流进行加压阻断，键，系统开始按照设定的参数对大鼠尾部血流进行加压阻断， 调节增益得到最佳的阻断波形。调节增益得到最佳的阻断波形。 11. 11. 系统默认的加气阻断时间为系统默认的加气阻断时间为10min10min，可根据实验要求更改，可根据实验要求更改， 但最少不能短于但最少不能短于1min1min。 12. 12. 达到设定时间后，系统会自动停止运行或者按达到设定时间

17、后，系统会自动停止运行或者按“启启/ /停停” 键停止实验，将波形保存以供分析。键停止实验，将波形保存以供分析。 无创血压测量系统注意事项无创血压测量系统注意事项 1. 1. 实验中应尽量将传感器放置在实验中应尽量将传感器放置在鼠尾根部鼠尾根部； 2. 2. 必须对大鼠进行正式实验前的必须对大鼠进行正式实验前的训练训练； 3. 3. 实验过程中应尽量实验过程中应尽量减少打开机箱门减少打开机箱门的次数；的次数； 4. 4. 如果实验的大鼠少于如果实验的大鼠少于 6 6 只，应该用橡胶塞将未只，应该用橡胶塞将未 使用通道的充气口阻塞。使用通道的充气口阻塞。 5. 5. 实验过程当中应保持实验过程当

18、中应保持安静安静。 实时定量实时定量PCRPCR技术技术 （ RealtimeRealtime Quantitative PCR Quantitative PCR ） PCRPCR（Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction） 技术的产生技术的产生 In 1983, Kary Mullis invented a process he called PCR, which solved a core problem in genetics: How to make copies of a strand of DNA you are inte

19、rested in. PCRPCR技术的应用技术的应用 定性定性（基因突变、基因分型等、甲基化检测等）（基因突变、基因分型等、甲基化检测等） 定量定量（基团拷贝数差异、基因表达，不同组织，（基团拷贝数差异、基因表达，不同组织， 不同时间，不同处理）不同时间，不同处理） “真正惊人的是真正惊人的是PCRPCR完全不是为解决某一个问题而设计的，完全不是为解决某一个问题而设计的， 该技术成熟之后，它所能解决该技术成熟之后，它所能解决 的问题才开始涌现的问题才开始涌现” 史蒂文史蒂文沙夫沙夫 RealtimeRealtime-PCR-PCR的产生、原理的产生、原理 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR

20、技术于技术于19961996年由美国年由美国Applied BiosystemsApplied Biosystems公司公司 推出。实时定量推出。实时定量PCRPCR技术是指在技术是指在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团， 利用扩增过程中利用扩增过程中荧光信号随产物累积荧光信号随产物累积实时监测整个实时监测整个PCRPCR进程，最进程，最 后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。 与普通与普通PCRPCR相比优点相比优点 特异性好特异性好（TaqmanTaqman法），使用特异性探针对定量分子法），使用特异性探针对定

21、量分子 进行识别，靶序列由引物和探针双重控制。进行识别，靶序列由引物和探针双重控制。 线性范围宽线性范围宽，即使模板量很小也能获得较为准确的检，即使模板量很小也能获得较为准确的检 测结果。测结果。 操作简单操作简单，省去纯化、电泳等产物后处理过程，高通，省去纯化、电泳等产物后处理过程，高通 量。量。 确保取值点处于指数增长期确保取值点处于指数增长期 RealtimeRealtime-PCR-PCR的类型的类型 p染料法染料法p探针法探针法 根据实验情况和条件选择合适的方法根据实验情况和条件选择合适的方法 SYBR GreenSYBR Green（染料法）（染料法） TagmanTagman（探

22、针法）（探针法） 性质性质可逆荧光可逆荧光积累荧光积累荧光 融解曲线分析融解曲线分析能能不能不能 特异性特异性 引物（非特异性扩增或引物（非特异性扩增或 引物二聚体有影响）引物二聚体有影响） 引物引物+ +探针探针 探针探针不需要不需要需要需要 通用性通用性通用通用专用专用 成本成本较低较低较高较高 相对定量计算方法（相对定量计算方法（2 2 - - CtCt） ） 样本1、2的参照基因 样本1的待测基因 样本2的待测基因 样本样本1- 1- 正常样本正常样本 样本样本2- 2- 病人样本病人样本 调查待测基因在病人调查待测基因在病人 样本中的表达与在正样本中的表达与在正 常人相比有何差别。常

23、人相比有何差别。 待测基因待测基因 (Ct)(Ct) 参照基因参照基因 (Ct)(Ct) 正常样正常样 本本 A AB B 病人样病人样 本本 C CD D 表达量表达量=2=2-(C-D)-(A-B) -(C-D)-(A-B) 表达量表达量11，表达上调，表达上调 表达量表达量11，表达下调，表达下调 RT-PCRRT-PCR实验过程中应注意的问题实验过程中应注意的问题 RNA RNA质量：完整性、纯度质量：完整性、纯度 反转录引物选择反转录引物选择 PCRPCR引物的设计引物的设计 加样前准备工作加样前准备工作 RNARNA质量质量 OD260/280OD260/280在在1.9-2.11

24、.9-2.1之间纯度最好之间纯度最好 小于小于1.81.8，表明蛋白杂质较多，表明蛋白杂质较多 大于大于2.22.2，表明，表明RNARNA已经降解已经降解 反转录引物选择反转录引物选择 Oligo dTOligo dT要求要求RNARNA必须有必须有Poly APoly A，适用于真核生，适用于真核生 物。适合长链、全长物。适合长链、全长RNARNA的的RTRT，对，对RNARNA样品质量要样品质量要 求较高，不能有断裂。求较高，不能有断裂。 Random PrimerRandom Primer适合各种适合各种RNARNA的的RTRT，尤其是丰度低，尤其是丰度低 的模板和具有复杂二级结构的模

25、板。的模板和具有复杂二级结构的模板。 PCRPCR引物的设计引物的设计 引物本身尽量不要有二级结构（上下游之间，引物本身尽量不要有二级结构（上下游之间， 发夹结构）发夹结构） GCGC数量之和与数量之和与ATAT数量之和相差不大，并且均匀数量之和相差不大，并且均匀 分布分布 产物片段不要太大，一般产物片段不要太大，一般100-200bp100-200bp左右为宜左右为宜 加样前的准备工作加样前的准备工作 将将DNADNA样品或样品或cDNAcDNA样品做适当稀释样品做适当稀释 标明加样板上每个孔中要加的模板及引物，标明加样板上每个孔中要加的模板及引物， 相同的样品尽量排列在一起，以免污染或错加

26、相同的样品尽量排列在一起，以免污染或错加 写明反应体系写明反应体系 写出清晰明了的分装示意写出清晰明了的分装示意 尤斯灌流室系统尤斯灌流室系统 （UssingUssing Chamber Chamber） 尤斯灌流室系统尤斯灌流室系统 1951 1951年年, ,丹麦学者丹麦学者 Hans UssingHans Ussing首次将首次将 UssingUssing chamber (chamber (尤斯灌流室尤斯灌流室) )介绍于世介绍于世, ,其主要功能是通过其主要功能是通过 微电极检测整个细胞膜离子通道变化的电流信号微电极检测整个细胞膜离子通道变化的电流信号, ,来来 反映肠道药物吸收、通

27、透性和分泌情况的变化。反映肠道药物吸收、通透性和分泌情况的变化。 上皮细胞电生理基础。上皮细胞电生理基础。 上皮组织构成：密集排列的上皮细胞上皮组织构成：密集排列的上皮细胞; ;细胞间质细胞间质 上皮组织特征上皮组织特征: : 极性极性: :细胞顶面和基底面结构和功能分布不均形成细胞顶面和基底面结构和功能分布不均形成 紧密连接紧密连接: : 阻止细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织阻止细胞外的大分子物质经细胞间隙进入组织 内。紧密连接的形状和渗透性决定上皮组织的完整性以及对物内。紧密连接的形状和渗透性决定上皮组织的完整性以及对物 质的阻抗力质的阻抗力( Rt( Rt ) )。 一般都能进行钳电

28、压和钳电流操作。一般都能进行钳电压和钳电流操作。 尤斯灌流室系统原理尤斯灌流室系统原理 尤斯灌流室系统组成尤斯灌流室系统组成 单个独立的尤斯灌流室（单个独立的尤斯灌流室（UssingUssing chamber chamber）；）； 用于控制温度的加热块；用于控制温度的加热块； 用于调节氧化与气升搅拌气流的针形阀；用于调节氧化与气升搅拌气流的针形阀； 用于测量跨上皮电压和通过电流的用于测量跨上皮电压和通过电流的Ag/AgClAg/AgCl参考参考 电极；电极； 与电压与电压/ /电流钳的连接导线。电流钳的连接导线。 打开水浴预热、尤斯灌流装置及计算机；打开水浴预热、尤斯灌流装置及计算机； 插

29、入电极、连接电极线、调零；插入电极、连接电极线、调零； 开气阀，系统条件稳定以后装入组织；开气阀，系统条件稳定以后装入组织； 打开打开Acquire and Analyze 2.3软件，开始记软件，开始记 录电流及电阻。录电流及电阻。 尤斯灌流室系统操作步骤尤斯灌流室系统操作步骤 目前目前, , 其应用主要集中在药学领域其应用主要集中在药学领域, ,通过微电极检测通过微电极检测 细胞膜离子通道的电流及电阻变化：细胞膜离子通道的电流及电阻变化： 测定测定转运电流转运电流：是否有载体或外流泵参与转运；：是否有载体或外流泵参与转运； 肠道的肠道的通透性通透性研究；研究； 研究药物的肠代谢、肠腔的分泌

30、情况；研究药物的肠代谢、肠腔的分泌情况； 研究药物对肠电生理参数的影响等。研究药物对肠电生理参数的影响等。 尤斯灌流室系统应用尤斯灌流室系统应用 膜片钳制技术膜片钳制技术 （Patch-clampingPatch-clamping） 德国科学家德国科学家Erwin NeherErwin Neher和和Bert SakmannBert Sakmann (1991(1991年诺贝尔医学生理学奖年诺贝尔医学生理学奖) )发明的可以记录单发明的可以记录单 一一离子通道电流离子通道电流的电生理学技术。的电生理学技术。 在单细胞膜片钳记录系统中，完整的在单细胞膜片钳记录系统中，完整的记录系统记录系统主主 要包括以下配置：要包括以下配置： n电子原件（膜片钳放大器、数模电子原件（膜片钳放大器、数模/ /模数转换模数转换 器）、器）、 n微操作器、微操作器、 n实验平台（防震台、屏避罩、空气泵）、实验平台（防震台、屏避罩、空气泵）、 n显微系统、显微系统、 n给药系统、给药系统、 n微电极拉制器、微电极拉制器、 n微电极抛光仪等。微电极抛光仪等。 膜片钳实验系统的基本配置膜片钳实验系统的基本配置 AxopatchAxopatch 200B 200B膜片钳放大器膜片钳放大器 n专门用于细胞膜电位信号放大的单探头超低噪专门用于细胞膜电位信号