归芪多糖对早衰WI―38细胞端粒酶活性的影响

1、归芪多糖对早衰 WI 38细胞端粒酶活性的影响摘要：目的 观察归芪多糖对过氧化氢（H2O2）诱导 的 WI-38 早衰细胞端粒酶活性的影响，并探讨其作用机制。 方法H2O2诱导建立早衰WI-38细胞模型，MTT法检测不同 浓度 H2O2 对 WI-38 细胞活力的影响，筛选出用于诱导细胞 早衰的H2O2浓度。实验细胞分为正常组、模型组和归芪多 糖组，化学染色法和 ELISA检测归芪多糖对衰老细胞B -半乳糖苷酶和端粒酶活性的影响。结果200卩mol/L H2O2可诱导18代WI-38细胞出现早衰。归芪多糖干预后早衰细胞B -半乳糖苷酶和端粒酶活性均未呈现出衰老样变化，与模型组 比较差异有统计学

2、意义 （P0.05）。结论 归芪多糖可明显增强 衰老细胞的端粒酶活性并显著抑制衰老相关B -半乳糖苷酶活性。关键词：归芪多糖；过氧化氢；WI-38细胞；B -半乳糖苷酶；端粒酶DOI： 中图分类号： R285.5 文献标识码： A 文章编号： 1005-5304（2015） 11-0050-04Effects of Guiqi Polysaccharide on Telomerase Activity in Premature Senescence WI-38 Cells PU Xiu-ying， YU Shuang，FAN Wen-bo， REN Jing， LIU Lu， MA Xiao-

3、long ， ZHANG Wei-jie （ College of Life Science and Engineering， Lanzhou University of Technology ；The Key Lab of Screening， Evaluation and Advanced Processing of TCM and Tibetan Medicine ， Gansu Educational Department ， Lanzhou 730050， China）Abstract ： Objective To investigate the effects of Guiqi p

4、olysaccharide （ GQP） on the telomerase activity in premature senescence of WI-38 cells ；To discuss its mechanism of action. Methods MTT assay was used to observe the effects of different concentrations of H2O2 on the proliferation of WI-38 cells and screened the best concentration of H2O2 to induce

5、premature senescence cellular model in WI-38 cells. ELISA and chemical staining method were used to evaluate the protection of GQP in telomerase activity andsenescence-associated -galactosidase activity in premature cellular senescence. Results 200口 mol/L H2O2 treatment couldinduce premature senesce

6、nce in WI-38 cells. There were no significant differences in senescence-associated B -galactosidase and telomerase activity between GQP group and normal control group （P0.05），but had significant difference with model group （P0.01）. Conclusion GQP can increase the telomerase activity and inhibit the

7、senescence-associatedgalactosidase activity in premature senescence of WI-38 cells.Key words：Guiqi polysaccharide；H2O2；WI-38 cell； senescence-associated B -galactosidase activity ; telomerase当归和黄芪是临床应用广泛的中药之一，是甘肃省道地 药材，具有调节免疫、抗氧化等药理作用，其主要成分有多 糖类、黄酮类、皂苷类、有机酸类及氨基酸等。 归芪多糖（ GQP） 是由当归和黄芪按照质量比1 : 5混合提取的植物

8、多糖，前期研究结果表明， GQP 具有显著的延缓衰老、抗氧化及抗病 毒活性1-3。本研究以过氧化氢（H2O2）诱导的早衰 WI-38 细胞模型为研究对象，观察GQP对衰老细胞B -半乳糖苷酶和端粒酶活性 的影响，并探讨其作用机制。1 实验材料1.1 细胞株人胚肺二倍体成纤维细胞 （WI-38 J0PDL）,批号611476 , 复旦大学细胞中心。1.2 药物GQP由甘肃省中藏药筛选评价及深加工重点实验室制备， 硫酸 -苯酚法测得其多糖含量为87.6%。不完全培养基溶解，经0.22卩m微孔滤膜过滤后，保存备用。1.3 主要试剂与仪器30%H2O2溶液（分析纯），上海凌峰化学试剂有限公司；H-DM

9、EM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，美国 Gibco 公司； 噻唑蓝（MTT）,美国Sigma公司；二甲基亚砜（DMSO）,上 海生工生物工程股份有限公司；细胞衰老B -半乳糖苷酶染色 试剂盒，江苏碧云天生物技术有限公司；人端粒酶酶联免疫 分析试剂盒，美国R&D公司。Heal Force HF 160W-水套式 C02 培养箱（上海力申公司） ， Model3550 型-酶联免疫分析仪 （美 国伯乐公司）,Olympus IX 51-倒置显微镜（日本 OLYMPUS 公司），流式细胞仪（美国 BD FACSCalibu）r，。2 实验方法2.1 分组含 10%胎牛血清的 H-DMEM 完全培养基

10、培养细胞生长至 90%融合时，按照1 : 4进行传代培养。所有细胞均采用传自 18代的 WI-38细胞。GQP组GQP先作用2 h后H2O2作用2 h, 模型组H2O2作用2 h，每日1次，连续4次。正常组常规培 养细胞，不做任何处理。2.2 WI-38 早衰细胞模型建立剂量-效应曲线确定H2O2染毒剂量90%融合单层 WI-38 细胞（ 18代） 0.25%胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液 密度，接种至96孔板中，每孔接种8X 103个，孵育24 h后 进行染毒。 H2O2 染毒剂量分别为 1、10、100、200、400、 800、1600、3200、6400卩mol/L ,每个剂量设 6个复

11、孔。 染毒 2 h 后 MTT 法检测。2.2.2 过氧化氢诱导早衰 WI-38 细胞 将长至 90%融合的 单层 WI-38 细胞（ 18 代）消化后接种于 6 孔板中，随机分为 H2O2组和空白对照组，每组 3孔。另外接种55代的细胞3 个孔作为复制衰老组。H2O2组以100、200、400卩mol/LH2O2染毒2 h后继续完全培养基培养，并于24、48、72 h各染毒2h，共染毒4次，染毒完毕后即进行后续实验。正 常组、复制衰老组正常培养细胞，不做任何处理。倒置显微 镜观察各组细胞形态，并拍照。2.3 MTT 法检测归芪多糖的最佳促生长浓度90%融合单层 WI-38 细胞（18代）0.

12、25%胰蛋白酶消化后，调整细胞悬液的密度，接种至 96孔板中，每孔接种 5X 103 个，孵育培养24 h后弃去上清液，每孔加入100卩L GQP溶 液，作用48 h后MTT法检测细胞存活率。 GQP给药浓度分别为 0、 0.006 4、 0.003 2、 0.016、 0.08、 0.4、 2 mg/mL ，每 组设 6 个复孔，实验重复 3 遍。2.4 流式细胞术分析细胞周期细胞分为GQP组、模型组和正常组（细胞诱导见“ 2.1 ” 项）。0.25%胰酶消化收集细胞后 900 r/min离心3 min，预冷PBS洗涤后再离心，弃上清液，重复3次。将离心后细胞重悬于1 mL预冷的75%乙醇中

13、，4 C固定过夜。离心，弃上清 液，向沉淀中加入1 mL染液（含50 mg/L碘化吡啶和50 mg/L 核糖核苷酸酶）缓慢充分重悬细胞，避光孵育30 min。流式 细胞仪采集数据进行细胞周期分析，并计算细胞增殖指数 （PI）。2.5衰老细胞B -半乳糖苷酶染色接种2.5 mL细胞悬液于6孔板（3.8 X 105个/孔细胞）， 分组同上，每组接种 3孔。孵育24 h后，PBS洗涤1次，加 入1 mL B -半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。弃去细胞固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min。每孔再加入1 mL染色工作液，37 C孵育过夜。倒置显微镜下观察，统计 各组染色阳性表达细胞（每

14、个视野计数 200 个细胞），计算 衰老细胞百分比并以蓝染率表示。蓝色细胞为B -半乳糖苷酶阳性表达的衰老细胞。2.6 端粒酶活性检测常规分组（同上） 培养细胞。 经胰酶消化收集各组细胞， PBS稀释细胞悬液，细胞密度调至1X 106个/mL。反复冻融使细胞破坏并释放细胞内成分，3000 r/min离心20 min，仔细收集上清液，按ELISA说明书490 nm处测其吸光度值，代 入标准曲线，计算各组细胞端粒酶活性。3 统计学方法采用SPSS18.C统计软件进行分析。实验数据以一x s表 示，组间比较采用方差分析及 LSD检验。PV0.05表示差异有 统计学意义。4 结果4.1 染毒剂量确定过

15、氧化氢剂量-效应曲线 以H2O2剂量对数值为横 坐标，细胞存活率（给药组吸光度+对照组吸光度x100%）为纵坐标绘制曲线，随着H2O2剂量的增加，细胞存活率逐渐降低，LD50在400800卩mol/L之间，约为700卩mol/L , 且细胞存活率介于 80%100%的H2O2浓度为100、200、400 卩mol/L。结果见图1。细胞形态学观察 H2O2浓度越大，细胞衰老样变 化越明显，当400卩mol/L H2O2作用时，细胞增殖停滞，凋 亡细胞增加。考虑后续实验，选择200卩mol/L作为体外衰老细胞的诱导条件。结果见图 2。4.2 归芪多糖对衰老细胞的影响归芪多糖最佳促细胞生长浓度测定以

16、GQP浓度为横坐标，细胞存活率（给药组吸光度+对照组吸光度x 100%）为纵坐标绘制曲线，随着GQP浓度增加，细胞存活率先增后降，最佳促生长浓度为 0.016 mg/mL ,见图3。实验 重复3次，结果均一致，因此，本研究中GQP组给药剂量均 设为 0.016 mg/mL。4.2.2 归芪多糖对早衰细胞进入细胞周期的影响 与正 常组比较，模型组细胞处于 G1 期比例明显增加（ P0.01）， 且PI显著降低（PV0.01）;而GQP可促进模型组细胞进入 S 期，使G1期细胞较模型组明显减少（PV0.01）,且PI显著增加（PvO.01）,见表1。流式细胞图见图 4423归芪多糖对B -半乳糖苷

17、酶活性的影响 衰老细胞 可高表达B -半乳糖苷酶，而B -半乳糖苷酶可催化X-半乳糖 苷，生成深蓝色产物，因此细胞中蓝色深浅可以间接表示酶 活性的高低，蓝色的多少可间接表示衰老细胞的数量 4。模 型组蓝染细胞数目最多且着色最深；而GQP组蓝染细胞数明显减少，与模型组比较差异有统计学意义（P0.05）,见图5、图 6 。4.2.4 归芪多糖对端粒酶活性的影响 端粒酶可将端粒 DNA 加至真核细胞染色体末端，能延长缩短的端粒，从而增 强细胞的增殖能力，因此端粒酶的活性与细胞增殖能力紧密 相关5。结果显示，H2O2可抑制细胞内端粒酶活性，与正 常组细胞有明显差异（ P 5 讨论细胞的衰老是不可逆的，

18、导致细胞衰老的原因主要有两 类：复制性衰老和应激状态下造成的早衰。前者是细胞程序 性衰老过程，而后者是在一些亚致死性应激如高氧、H2O2、紫外线、慢性炎症等作用下细胞提前发生衰老 6。H2O2分 子小、易于穿透细胞膜，被认为是良好的氧化应激诱导剂， 因此，本研究以 H2O2为诱导剂诱导细胞衰老。从H2O2剂量-效应曲线看出，随着 H2O2 剂量增加，细胞存活率下降， LD50约为700卩mol/L ,在100卩mol/L及以下浓度时 H2O2 无明显细胞毒性。本研究选择100、200、400卩mol/L H2O2诱导早衰细胞模型，结果发现，200卩mol/L H2O2成功诱导早衰细胞，且未对细

19、胞造成明显损伤，与复制衰老组细胞比 较，胞体体积变大，胞内出现较多的空泡和颗粒物等早衰现 象。因此，本研究选择200卩mol/L剂量作为H2O2诱导早衰的给药剂量，此实验结果与相关报道一致 6-7 。细胞衰老端粒学说认为，在细胞分裂过程中，端粒由于 不能为 DNA 聚合酶完全复制而逐渐变短， 当端粒缩短到一定 阈值时，细胞就进入衰老过程。端粒酶的功能主要在于合成 染色体末端的重复序列，以维持端粒的长度和稳定性，从而 增强细胞增殖能力。已有研究表明，在正常人体细胞中，适 当激活端粒酶活性可以延长细胞寿命， 达到抗衰老的作用 8 因此， 本研究观察了 GQP 对衰老细胞端粒酶活性的影响，结果表明，

20、 0.016 mg/mL GQP 可明显促进 WI-38 细胞的增殖， 并可使H2O2诱导的早衰细胞端粒酶活性显著增强。此结果 提示， GQP 促进细胞生长作用与增强细胞端粒酶活性有关。参考文献：1 Pu XY，Li Y， Zhou LY. Deferring senile effect ofpolysaccharides from Angelica and Astragalus on aging miceJ. Human Health and Biomedical Engineering ， 2011：289-292.2 蒲秀瑛，李言，张伟杰 .归芪多糖延缓衰老作用的研究J天然产物研究与开发，2012，24（ 11）： 1630-1633.3 Pu XY， Y