重组DNA技术精简PPT学习教案

1、会计学1 重组重组DNA技术精简技术精简 第1页/共29页 第2页/共29页 存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有细菌的抗药基因。 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含EcoR，BamH，Hind等单一的限制酶切点。 第3页/共29页 第4页/共29页 第5页/共29页 2人工合成： 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。适应于编码小分子多肽的基因。 第6页/共29页 第7页/共29页 第8页/共29页 第9页/共29页 PCR概述

2、PCR：使用一对寡核苷酸引物，以目的序列为模板，利用DNA合成 酶和四种脱氧 核糖核酸进行DNA的体外合成反应。 PCR技术具有灵敏度高，特异性高、操作方便和重复性好等特点，能够在几个小时 内获得多达几百万拷贝的目的基因。 该技术在上个世纪80年代中期由美国K.Mullis发明建立，经过近二十年已发展成包 括多种衍生技术，在很多领域中广泛使用，K.Mullis也因此获得1993年度的诺贝尔化学 奖。 第10页/共29页 PCR基本原理 DNA在细胞中的复制是一个复杂的酶促脱氧核糖核酸聚合过程，是 DNA聚合 酶、DNA连接酶、引发酶、DNA引物、四种脱氧核糖核酸、DNA超螺旋酶、离子 环境等多

3、成份参与的过程。 PCR是在试管内使用最基本的成份模拟了细胞内的DNA复制，所以在一个PCR 中必需成分是 1. 模板DNA 2. DNA聚合酶 3. 四种脱氧核糖核酸 4. 正向和反向两条引物 5. 适当的缓冲体系。 第11页/共29页 1.变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的DNA分子；在应用Taq DNA聚 合酶进行PCR反应时，变性往往在9495条件下进行。这也是Taq DNA聚合酶进 行30个左右的PCR循环而活力不致受到过多损失时所能耐受的最适温度。 2.退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退火温度比两条寡核苷酸引 物的熔解温度低510，PCR实验要对退

4、火温度进行优化。 PCR基本步骤 第12页/共29页 3.延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则，催化四种脱氧核糖核酸 加在引物的3端，使引物沿53方向生成与模版DNA互补的新DNA链。 双链模版 DNA 变性 退火 53 53 5 53 3 5 5 3 3 5 5 3 3 上游引物 下游引物 延伸 3 5 5 3 3 5 5 3 多次循环 （2n 拷贝） 第13页/共29页 1、目的基因的克隆 2、基因的体外突变 3、DNA和RNA的微量分析 4、DNA序列测定 5、基因突变分析 PCR的主要用途 第14页/共29页 第15页/共29页 第16页/共29页 第17页/共29页

5、第18页/共29页 四、重组DNA导入受体细胞 （一）转化（transformation） 转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在CaCl2溶液中，并置于低温（05）环境下一段时间，钙离子使细胞膜的结构发生变化，通透性增加，从而具有摄取外源DNA的能力，这种细胞称为感受态细胞（competent cell）。 第19页/共29页 (二)感染（infection） 噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导（transduction）。 第20页/共29页 (三)转染（transfection） 转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。 常用的方法有电穿孔法（electroporation）、磷酸钙沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中，也可以在染色