综合性实验一质粒DNA的小量制备和电泳鉴定PPT学习教案

1、会计学1 综合性实验一质粒综合性实验一质粒DNA的小量制备和电的小量制备和电 泳鉴定泳鉴定 第1页/共29页 质粒质粒 plasmid 质粒是细菌染色体外的环质粒是细菌染色体外的环 形双链形双链DNA分子，能在宿分子，能在宿 主细胞内独立自主的进行主细胞内独立自主的进行 复制。复制。 质粒质粒 基因工程中目基因工程中目 的基因的运载的基因的运载 工具。工具。 质粒载体质粒载体 第2页/共29页 大小可从大小可从1kb到到200kb 筛选标记筛选标记 多克隆位点多克隆位点 酶切位点酶切位点 复制原点复制原点 第3页/共29页 质粒的特性：质粒的特性： 能独立自主进行复能独立自主进行复 制。制。

2、细菌内的共生型遗细菌内的共生型遗 传因子，能垂直遗传传因子，能垂直遗传 。 能赋予宿主细胞一能赋予宿主细胞一 些表型。些表型。 质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些 酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿 主即使没有它们也可以正常存活。主即使没有它们也可以正常存活。 第4页/共29页 第5页/共29页 大多数来自细菌的质大多数来自细菌的质 粒是粒是双链双链、共价闭合共价闭合 环状环状的分子，以的分子，以超螺超螺 旋形式旋形式存在。存在。 第6页/共29页 Visualization of topois

3、omers. In this experiment, all DNA molecules have the same number of base pairs but exhibit some range in the degree of supercoiling. Because supercoiled DNA molecules are more compact than relaxed molecules, they migrate more rapidly during gel electrophoresis. 第7页/共29页 n琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结琼脂糖是由琼脂分

4、离制备的链状多糖。其结 构单元是构单元是D-半乳糖和半乳糖和3.6-脱水脱水-L-半乳糖。许半乳糖。许 多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相 盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶 。 n因此该凝胶适合于核酸与核蛋白、免疫复合因此该凝胶适合于核酸与核蛋白、免疫复合 物的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中物的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中 也常用于也常用于LDH、CK等同工酶的检测。等同工酶的检测。 第8页/共29页 影响电泳迁移率的因素： FrictionCharge 外加电流、电压 分子量 分子形状分子的等电点

5、 Voltage CATHODE ANODE +- - + 第9页/共29页 径变小，环状径变小，环状DNA（球形）不（球形）不 能进入胶中，相对迁移率为能进入胶中，相对迁移率为0， 而同等大小的直线而同等大小的直线DNA（刚性（刚性 棒状）可以按长轴方向前移，相棒状）可以按长轴方向前移，相 对迁移率大于对迁移率大于0。 第10页/共29页 差速离心差速离心 DIFFERENTIAL DIFFERENTIAL CENTRIFUGATIONCENTRIFUGATION 第11页/共29页 第12页/共29页 质粒提取原理质粒提取原理 质粒提取有多种方法，但都包含三个基本步骤：质粒提取有多种方法，

6、但都包含三个基本步骤： 1. 培养细菌使质粒扩增培养细菌使质粒扩增 2. 收集裂解细菌收集裂解细菌 3. 分离纯化质粒分离纯化质粒DNA 去除蛋白质去除蛋白质去除去除RNA去除基因组去除基因组DNA 苯酚苯酚-氯仿抽提法氯仿抽提法Rnase消化法消化法？ 第13页/共29页 质粒质粒DNA和基因组和基因组DNA的区的区 别别 1.大小不同大小不同 2.变性与复性有差异变性与复性有差异 质粒质粒DNA较小，通常只较小，通常只 有基因组有基因组DNA分子量的分子量的 百分之一。百分之一。 基因组基因组DNA容易断裂线容易断裂线 性化。性化。 第14页/共29页 分离质粒分离质粒DNA和基因组和基因

7、组DNA的方法的方法 碱变性法碱变性法 煮沸法煮沸法 羟基磷灰石层析法等羟基磷灰石层析法等 第15页/共29页 碱裂解法提取质粒的原理碱裂解法提取质粒的原理 第16页/共29页 原理：原理： 1. 强碱强碱NaOH和和SDS裂解裂解细菌，细菌中的质粒细菌，细菌中的质粒DNA和基和基 因组因组DNA在强碱条件下发生变性。在强碱条件下发生变性。 2. 怎样去除基因组怎样去除基因组DNA？ 当加入当加入酸酸性物质进行性物质进行中和中和时，质粒时，质粒DNA很快复性，很快复性， 而染色体而染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以 复性，并形成沉淀，经过离心随细胞碎片

8、一起去除。复性，并形成沉淀，经过离心随细胞碎片一起去除。 3. 怎样去除蛋白质？怎样去除蛋白质？ 留有质粒留有质粒DNA的上清，经的上清，经酚酚/氯仿去除蛋白质氯仿去除蛋白质后，用后，用 乙醇沉淀乙醇沉淀DNA，即得到质粒，即得到质粒DNA。 第17页/共29页 Biospin质粒质粒DNA小量提取试剂盒：小量提取试剂盒： Resuspension buffer, Lysis buffer, Neutralization buffer, wash buffer, Elution buffer, RNase solution, Spin columns. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳： 电泳仪

9、，电泳槽，紫外灯电泳仪，电泳槽，紫外灯 琼脂糖，琼脂糖，50XTAE电泳缓冲液，电泳缓冲液，6X点样缓冲液，点样缓冲液，DNA Marker，溴化乙啶（荧光染料，结合，溴化乙啶（荧光染料，结合DNA并在紫外线并在紫外线 下显示）下显示） 第18页/共29页 第19页/共29页 第20页/共29页 Resuspension Buffer 细胞悬浮液细胞悬浮液 Lysis Buffer 碱裂解液碱裂解液 Neutralization Buffer 中和液中和液 Spin column 吸附柱吸附柱 Wash Buffer 漂洗液漂洗液 Elution Buffer 洗脱缓冲液洗脱缓冲液 第21页/

10、共29页 第22页/共29页 2) 按水平板的长按水平板的长宽宽0.5cm胶厚，量取胶厚，量取1TAE ，并按，并按0.8的浓度称取琼脂糖（的浓度称取琼脂糖（agarose），在），在 微波炉或电炉上加热至全熔（清澈透明）。微波炉或电炉上加热至全熔（清澈透明）。 第23页/共29页 第24页/共29页 3) 等凝胶温度降至大约等凝胶温度降至大约5060以下时，加入以下时，加入1 mg/L 溴化乙锭（溴化乙锭（EB）至终浓度为）至终浓度为0.5g/mL ；摇匀并轻快地；摇匀并轻快地 倒入水平板中，除掉气泡。倒入水平板中，除掉气泡。 4) 凝固后，将梳子轻轻拔出。凝固后，将梳子轻轻拔出。 5) 去掉胶带，将水平板放入加有去掉胶带，将水平板放入加有1TAE电泳缓冲液的电泳缓冲液的 电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约1mm。 第25页/共29页 6) 6) 上样上样Buffer Buffer 和和DNA DNA 混匀后点样，记录点样次序。混匀后点样，记录点样次序。 7) 7) 在水平板两边的点样孔中分别加入在水平板两边的点样孔中分别加入markermarker即分子量即分子量 标记。标记。 8) 8) 盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压（盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压