焦磷酸测序PPT学习教案

1、会计学1 焦磷酸测序焦磷酸测序 基因测序基因测序 对对DNADNA分子的核苷酸排列顺序的测分子的核苷酸排列顺序的测 定，也就是测定组成定，也就是测定组成DNADNA分子的分子的A A、T T 、G G、C C的排列顺序。的排列顺序。 A-T-T-C-A-C-G-G-T-A-CA-T-T-C-A-C-G-G-T-A-C 第1页/共22页 焦磷酸测序步骤焦磷酸测序步骤 一一 PCR PCR 二二 焦磷酸测序焦磷酸测序 第2页/共22页 第3页/共22页 PCR 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 亦称之为亦称之为DNA扩增，扩增，是是 DNA复制的体外模拟复制的体外模拟 第4页/共22页 普通普通PCR

2、 实时荧光定量实时荧光定量PCR 第5页/共22页 PCR反应的基本步骤反应的基本步骤 高温变性高温变性 低温退火低温退火 适温延伸适温延伸 l 具有特异性强、灵敏度高、具有特异性强、灵敏度高、 操作简便、省时等特点操作简便、省时等特点 第6页/共22页 一、一、PCR反应的条件反应的条件 1 1、一定的缓冲溶液；、一定的缓冲溶液； 2 2、DNADNA模板；模板； 3 3、分别与两条模板链相结合的两种引物；、分别与两条模板链相结合的两种引物； 4 4、四种脱氧核苷酸：、四种脱氧核苷酸：4 4种种dNTPdNTP混合物；混合物； 5 5、耐热的、耐热的DNADNA聚合酶；聚合酶； 6 6、控制

3、温度（控制温度（PCRPCR重要条件）重要条件）。 第7页/共22页 二、二、DNA变性和复性变性和复性 在在80-10080-100的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的双的双 螺旋结构将解体，双链分开，这个过螺旋结构将解体，双链分开，这个过 程称为程称为变性变性；当温度缓慢降低后，两；当温度缓慢降低后，两 条彼此分离的条彼此分离的DNADNA链又会重新结合成双链又会重新结合成双 链，这个过程称为链，这个过程称为复性复性。 第8页/共22页 三、复制方向（三、复制方向（53） 1 1、DNADNA分子的分子的33端与端与55端：端：-OH-OH端为端为 3; ; 磷酸基团的末端为磷酸基团

4、的末端为5 5 。 2 2、DNADNA分子由两条反向平行的脱氧核苷分子由两条反向平行的脱氧核苷 酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连 接而成。接而成。 第9页/共22页 1 1、DNADNA聚合酶催化聚合酶催化 2 2、DNADNA的延伸方向的延伸方向:5-3:5-3 第10页/共22页 四、引物问题四、引物问题 1 1、两种引物两种引物：DNADNA或或RNARNA，长度，长度15-30bp15-30bp， 常用为常用为20bp20bp左右。左右。 2 2、原因原因：DNADNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成 DNADNA，只能从，只能从33端

5、延伸端延伸DNADNA链。链。 第11页/共22页 五、五、PCR过程过程 变性变性 复性复性延伸延伸 1 1、变性：当温度上升到、变性：当温度上升到90 90 以上时，双链以上时，双链 DNADNA解为单链解为单链。 第12页/共22页 2 2、复性：温度下降到、复性：温度下降到50 50 左右，两种引物左右，两种引物 通过碱基互补配对与两条单链通过碱基互补配对与两条单链DNADNA结合结合 第13页/共22页 3 3、延伸：温度上升到、延伸：温度上升到7272左右，溶液中的左右，溶液中的 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(A(A，T T，C C，G)G)在在DNADNA聚合酶聚合酶 的作用下，

6、根据碱基互补配对原则合成新的的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 DNADNA链。链。 第14页/共22页 4、 循环特点：循环特点： 上一次循环的产物为下一循环上一次循环的产物为下一循环 的模板的模板 结果单链中有最初母链的只两结果单链中有最初母链的只两 条（无引物存于两个子代条（无引物存于两个子代DNADNA分子分子 中中 ） ，其它子代，其它子代DNADNA分子都为双分子都为双 引物分子引物分子 处于两引物之间的处于两引物之间的DNADNA序列呈序列呈 指数增长指数增长1 12N2N 第15页/共22页 焦磷酸测序焦磷酸测序 第16页/共22页 第17页/共22页 第18页/共22页 峰形图峰形图 峰高与结合