血管组织工程

1、2021/3/11 1 血管组织工程血管组织工程 2021/3/11 2 目录 1 绪论绪论 2 支架材料支架材料 3 种子细胞种子细胞 4 生长因子的引入生长因子的引入 5 生物反应器生物反应器 6 展望展望 2021/3/11 3 1、绪论、绪论 u 组织工程学（组织工程学（tissue engineering）是一门工）是一门工 程学与生命科学相结合的边缘科学，是在体程学与生命科学相结合的边缘科学，是在体 外构建具有生物活性的生物替代物，用于替外构建具有生物活性的生物替代物，用于替 代、修复或改善人体各种组织器官形态和功代、修复或改善人体各种组织器官形态和功 能。能。 u 基本原理：基本

2、原理： 种子细胞种子细胞 生物反应器 生物反应器 细胞细胞-生物材料复合物生物材料复合物 植入人体植入人体 支架材料支架材料 2021/3/11 4 u 组织工程化血管是利用组织工程学方法，组织工程化血管是利用组织工程学方法， 用血管种子细胞用血管种子细胞(内皮细胞，平滑肌细胞内皮细胞，平滑肌细胞) 与相关细胞外基质与相关细胞外基质(支架材料支架材料)复合，以构复合，以构 建从形态到功能都接近活体血管的组织工建从形态到功能都接近活体血管的组织工 程化血管。程化血管。 2021/3/11 5 组织工程血管应具备以下条件：组织工程血管应具备以下条件： u 具有或模拟体内血管壁三层结构具有或模拟体内

3、血管壁三层结构 u 具有生物相容性，不易产生血栓，不易具有生物相容性，不易产生血栓，不易 发生免疫排斥反应发生免疫排斥反应 u 具有生物学特性，如对药物刺激有收缩具有生物学特性，如对药物刺激有收缩 性性 u 具有血管的力学特性，即有粘弹性并能具有血管的力学特性，即有粘弹性并能 承受一定的压力承受一定的压力 2021/3/11 6 u 1986年，年，Weinberg CBWeinberg CB等最早应用自体等最早应用自体 来源的平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮来源的平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮 细胞构建了复合的组织工程化血管，但细胞构建了复合的组织工程化血管，但 血管强度无法满足回植要求血管强度无

4、法满足回植要求 uL heureux等人在等人在 vitamin C存在条件下存在条件下, 通过培养间充质细胞通过培养间充质细胞(平滑肌细胞和成纤平滑肌细胞和成纤 维细胞维细胞)提高了移植物的机械强度提高了移植物的机械强度, 构建构建 了一个具有类似生理血管的脱细胞基质了一个具有类似生理血管的脱细胞基质 (脱细胞基质是成人皮肤的脱水产物脱细胞基质是成人皮肤的脱水产物)。 2021/3/11 7 uNikalson等在血流条件下在聚合物管道等在血流条件下在聚合物管道 上构建血管上构建血管 uNiklason 等注意到在类似活体内或者能等注意到在类似活体内或者能 够经历自然形成阶段等外环境条件下能

5、够经历自然形成阶段等外环境条件下能 够更好的形成血管移植物够更好的形成血管移植物 2021/3/11 8 Hemothes膨体聚四氟乙烯人工血管膨体聚四氟乙烯人工血管 2021/3/11 9 2021/3/11 10 2、支架材料、支架材料 天然材料天然材料 支架材料支架材料 人工合成材料人工合成材料 复合材料复合材料 2021/3/11 11 2.1 天然材料天然材料 2021/3/11 12 优点优点 u本身包含许多生物信息，能够提供细胞所本身包含许多生物信息，能够提供细胞所 需的信号需的信号 u与细胞亲和性强，能为细胞提供近似体内与细胞亲和性强，能为细胞提供近似体内 的发生发育的细胞外基

6、质支架条件，能使的发生发育的细胞外基质支架条件，能使 细胞聚集成组织，控制组织结构，调节细细胞聚集成组织，控制组织结构，调节细 胞表型胞表型 u极低的免疫排斥反应，良好的顺应性极低的免疫排斥反应，良好的顺应性 2021/3/11 13 u现在应用较多的脱细胞血管基质材料均富现在应用较多的脱细胞血管基质材料均富 含胶原，保持着胶原纤维、弹性蛋白等结含胶原，保持着胶原纤维、弹性蛋白等结 构蛋白的构象和原有的排列分布，力学性构蛋白的构象和原有的排列分布，力学性 能及强度与脱细胞前相似。能及强度与脱细胞前相似。 u胶原支架用碳胶原支架用碳- -二酰亚氨交联后，抗降解能二酰亚氨交联后，抗降解能 力增强。

7、种植成纤维细胞时细胞黏附、增力增强。种植成纤维细胞时细胞黏附、增 殖能力强。殖能力强。 2021/3/11 14 脱细胞基质支架材料脱细胞基质支架材料 u 动物体内多种纤维组织（心包膜、筋膜等）动物体内多种纤维组织（心包膜、筋膜等） u 内脏平滑肌器官内脏平滑肌器官 u 小肠黏膜下层小肠黏膜下层( (small intestinal submucosa,SISsmall intestinal submucosa,SIS) ) 2021/3/11 15 2021/3/11 16 2.2 人工合成高分子生物材料人工合成高分子生物材料 优点优点 u可预先设计和调控，降解完全，可避免异可预先设计和调控

8、，降解完全，可避免异 物刺激所引起的不良反应物刺激所引起的不良反应 u生产重复性好，可大批量生产生产重复性好，可大批量生产 2021/3/11 17 缺点缺点 u缺乏生物信号和功能基团，与种子细胞缺乏生物信号和功能基团，与种子细胞 的黏附性较差的黏附性较差 u在材料降解过程中，会产生一些酸性物在材料降解过程中，会产生一些酸性物 质，对局部会产生一定的影响质，对局部会产生一定的影响 2021/3/11 18 u血管组织工程应用的人工合成可降解材料血管组织工程应用的人工合成可降解材料 有聚羟基乙酸有聚羟基乙酸(PGA),(PGA),聚乳酸聚乳酸(PLA),(PLA),聚聚L-L-乳乳 酸酸(PLL

9、A)(PLLA)及上述材料的共聚物及上述材料的共聚物(PLGA),(PLGA),聚羟聚羟 基烷酸酯基烷酸酯(PHA)(PHA)、聚、聚-4-4-羟基丁酸羟基丁酸(P4HB) (P4HB) 等。等。 其中作为血管支架材料应用最多的是其中作为血管支架材料应用最多的是PGAPGA和和 PLGAPLGA。 2021/3/11 19 uPGAPGA的吸收和代谢机制已经明确并具有可的吸收和代谢机制已经明确并具有可 靠的生物安全性，但靠的生物安全性，但PGAPGA降解速度过快降解速度过快 u最典型的共聚物是羟基乙酸最典型的共聚物是羟基乙酸(GA)(GA)和乳酸和乳酸 (LA)(LA)形成的无规则共聚物形成的

10、无规则共聚物- -聚乳酸聚羟基聚乳酸聚羟基 乙酸乙酸(PLGA)(PLGA)。PLGAPLGA共聚物的降解速度可共聚物的降解速度可 根据需要通过调整两种单体的比例来加根据需要通过调整两种单体的比例来加 以控制。以控制。 2021/3/11 20 PGA血管支架（胶原包埋）血管支架（胶原包埋） 2021/3/11 21 u 聚乳酸聚乳酸(PLA)(PLA) 优点：无毒害作用优点：无毒害作用 缺点：缺乏良好细胞亲和性能缺点：缺乏良好细胞亲和性能 u 聚聚 - -己内酯己内酯(PCL)(PCL) 具有良好的亲水性具有良好的亲水性 2021/3/11 22 2.3 复合材料复合材料 u人工合成材料的优

11、点是它们的强度、降解速度、人工合成材料的优点是它们的强度、降解速度、 微结构和渗透性均可在生产过程中进行控制微结构和渗透性均可在生产过程中进行控制 u天然材料的优点则在于包含有生物信息天然材料的优点则在于包含有生物信息( (如特殊如特殊 的氨基酸序列的氨基酸序列) )，可促进细胞吸附或使细胞保留，可促进细胞吸附或使细胞保留 分化功能分化功能 u通过合成材料与天然可降解高分子材料复合，通过合成材料与天然可降解高分子材料复合， 可以在保持支架材料的力学强度及降解行为不可以在保持支架材料的力学强度及降解行为不 变的前提下，获得具有生物活性的表面变的前提下，获得具有生物活性的表面 2021/3/11

12、23 3 种子细胞种子细胞 正常的血管壁有内膜、中膜、外膜构成。正常的血管壁有内膜、中膜、外膜构成。 内皮细胞（单层）内皮细胞（单层） 内膜内膜 内皮下层内皮下层 平滑肌细胞（多层环形排列）平滑肌细胞（多层环形排列） 中膜中膜 细胞外基质细胞外基质 外层外层 疏松结缔组织疏松结缔组织 2021/3/11 24 u 内皮细胞和平滑肌细胞是血管的重要组成内皮细胞和平滑肌细胞是血管的重要组成 成分，因此是组织工程化血管种子细胞的成分，因此是组织工程化血管种子细胞的 主要研究内容主要研究内容 u目前用于构建组织工程血管的种子细胞主目前用于构建组织工程血管的种子细胞主 要分自体血管壁细胞和干细胞两大类要

13、分自体血管壁细胞和干细胞两大类 2021/3/11 25 3.1 自体血管壁细胞自体血管壁细胞 3.1.1 静脉内皮细胞静脉内皮细胞 u从体内非必须血管或者人脐静脉内皮，一从体内非必须血管或者人脐静脉内皮，一 般采用般采用酶消化法酶消化法 u静脉内皮获取的方法已经成熟，但是在体静脉内皮获取的方法已经成熟，但是在体 外培养中容易老化，表型和功能容易丢失，外培养中容易老化，表型和功能容易丢失， 细胞增殖能力和活性等因人而异，而且，细胞增殖能力和活性等因人而异，而且， 体外培养扩增的时间较长，难以达到血管体外培养扩增的时间较长，难以达到血管 构建种子细胞的要求构建种子细胞的要求 2021/3/11

14、26 3.1.2 血管平滑肌细胞血管平滑肌细胞 u 取材时损伤较大取材时损伤较大 u 伤口容易感染伤口容易感染 u 获得的细胞在体外培养下容易丧失平滑肌获得的细胞在体外培养下容易丧失平滑肌 细胞表型细胞表型 u容易衰老容易衰老 2021/3/11 27 3.2 干细胞（干细胞（Stem cells） u 干细胞具有能自我复制、多向分化的潜能，干细胞具有能自我复制、多向分化的潜能， 且增殖能力强，具有稳定传代的功能。因且增殖能力强，具有稳定传代的功能。因 此成为理想的组织工程种子细胞。此成为理想的组织工程种子细胞。 胚胎干细胞胚胎干细胞 u干细胞干细胞 内皮祖细胞内皮祖细胞 成体干细胞成体干细胞

15、 骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞 2021/3/11 28 2021/3/11 29 3.2.1 胚胎干细胞（胚胎干细胞（Embryo stem cells,ESCs） u 胚胎干细胞存在于哺乳动物发育的早期，胚胎干细胞存在于哺乳动物发育的早期， 是指由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体是指由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体 外抑制培养而筛选出的细胞外抑制培养而筛选出的细胞 u具有具有“发育全能性发育全能性”，还具有持续增殖而，还具有持续增殖而 不分化的能力不分化的能力 2021/3/11 30 3.2.2 成体干细胞成体干细胞 u成体干细胞按照其来源和分化方向的不同成体干细胞按照其来源和分化方向

16、的不同 可以分为造血干细胞、骨髓间充质干细胞、可以分为造血干细胞、骨髓间充质干细胞、 内皮祖细胞、神经干细胞、表皮干细胞、内皮祖细胞、神经干细胞、表皮干细胞、 脂肪干细胞等，适用于组织工程血管构建脂肪干细胞等，适用于组织工程血管构建 的有的有内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞内皮祖细胞和骨髓间充质干细胞 u自体移植的成体干细胞可以避免免疫排斥自体移植的成体干细胞可以避免免疫排斥 的问题，分离使用成体干细胞不存在伦理的问题，分离使用成体干细胞不存在伦理 社会问题社会问题 2021/3/11 31 3.2.2.1 内皮祖细胞内皮祖细胞( (EPCsEPCs，endothelial endothelial

17、 progenitor cellsprogenitor cells） uEPCs是一群是一群CD34+的细胞，最早由的细胞，最早由 Asahara等从人外周血中分离得到，在体等从人外周血中分离得到，在体 外可以诱导分化为内皮细胞，参与了新生外可以诱导分化为内皮细胞，参与了新生 血管的形成。血管的形成。EPCs具有和造血干细胞一些具有和造血干细胞一些 共表达的标志，如共表达的标志，如:flk-1，Tie-2等，认为等，认为 二者都源自成血管祖细胞。二者都源自成血管祖细胞。 2021/3/11 32 u优点：优点：EPCs具有容易获得和很强的增殖具有容易获得和很强的增殖 能力能力 u缺点：缺点：

18、1.体外扩增培养时间较长体外扩增培养时间较长 2.关于关于EPCs本身的特殊标志，来源本身的特殊标志，来源 较少较少“不稳定不稳定”，有效的分离聚集办法等，有效的分离聚集办法等 都还在摸索阶段，而且在一些特定的病理都还在摸索阶段，而且在一些特定的病理 条件下条件下“其表型会发生改变其表型会发生改变”， 3.生物学活性下降生物学活性下降 2021/3/11 33 光镜下的细胞学形态A :刚分离的单个核细胞,细胞呈小圆( 40) ;B : 培养4 d后的内皮祖细胞细胞变大、 透亮度增强、 出现梭形细胞 ( 40) ;C:培养7 d后的内皮祖细胞细胞数量增多,有较多的小杆形细 胞和梭形细胞( 40)

19、 ;D :培养 7 d 后的细胞团呈集落样生长( 10) -方叶青.外周血内皮祖细胞分离和培养的试验研究 2021/3/11 34 3.2.2.2 骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞 （BMSCs,bone marrow mesenchymal stem cells） u间充质细胞间充质细胞(MSC)(MSC)最初是由最初是由Friedenstein发现的一发现的一 类易贴附于塑料培养板表面的细胞。在机体内类易贴附于塑料培养板表面的细胞。在机体内MSCMSC 存在于许多组织中，尤以骨髓中最多，简单的骨存在于许多组织中，尤以骨髓中最多，简单的骨 髓穿刺即可获得，不存在组织配型及免疫排斥问髓穿刺即可

20、获得，不存在组织配型及免疫排斥问 题，理论上能分化为所有的间充质组织类型，如题，理论上能分化为所有的间充质组织类型，如: : 软骨、脂肪、肌肉及肌健等。软骨、脂肪、肌肉及肌健等。 2021/3/11 35 u 有研究表明，骨髓间充质干细胞在体有研究表明，骨髓间充质干细胞在体 外能够分化为血管平滑肌细胞。有文献外能够分化为血管平滑肌细胞。有文献 报道，在血管损伤修复的过程中，骨髓报道，在血管损伤修复的过程中，骨髓 间充质干细胞参与了血管平滑肌层的重间充质干细胞参与了血管平滑肌层的重 建过程。这些为建过程。这些为BMSCsBMSCs诱导分化为血管诱导分化为血管 平滑肌细胞提供了依据，为组织工程血平

21、滑肌细胞提供了依据，为组织工程血 管平滑肌种子细胞提供了选择的可能。管平滑肌种子细胞提供了选择的可能。 2021/3/11 36 4 生长因子的引入生长因子的引入 u 动物体中存在着大量对于细胞生长、分化、动物体中存在着大量对于细胞生长、分化、 代谢、凋亡进行调控的生长因子代谢、凋亡进行调控的生长因子( (growth factor) )，这些因子对于组织器官正常功能，这些因子对于组织器官正常功能 的维持起着至关重要的作用的维持起着至关重要的作用 u常用的生长因子有成纤维细胞生长因子常用的生长因子有成纤维细胞生长因子 (FGF)、转化生长因子、转化生长因子(TGF-)、胰岛素样、胰岛素样 生长

22、因子生长因子(IGF)、血小板衍化生长因子、血小板衍化生长因子 (PDGF)、骨形态发生蛋白、骨形态发生蛋白(BMP)等。等。 2021/3/11 37 2021/3/11 38 在人工合成的高分子和大部分天然高在人工合成的高分子和大部分天然高 分子材料中，缺乏这些生长因子或者这些分子材料中，缺乏这些生长因子或者这些 生长因子大部分在材料制备过程中遭到了生长因子大部分在材料制备过程中遭到了 破坏。因此，将生长因子负载到组织工程破坏。因此，将生长因子负载到组织工程 支架上，也是越来越被关注的问题。支架上，也是越来越被关注的问题。 2021/3/11 39 u在材料中引人生长因子、黏附因子等，可在

23、材料中引人生长因子、黏附因子等，可 以对细胞生长、分化、增殖起到促进作用以对细胞生长、分化、增殖起到促进作用 u在此基础上，可以将表达生长因子的基因在此基础上，可以将表达生长因子的基因 片断负载到支架上进行基因治疗片断负载到支架上进行基因治疗 2021/3/11 40 5 生物反应器生物反应器 u 生物反应器是指对微生物生物反应器是指对微生物/动物细胞培动物细胞培 养环境和运行参数（如：养环境和运行参数（如：PH值、温度、值、温度、 压力、营养的供给和废物的移出）进行压力、营养的供给和废物的移出）进行 监测和调控的一种装置。监测和调控的一种装置。 2021/3/11 41 类型 u搅拌式生物反应器搅拌式生物反应器 u旋转壁式生物反应器旋转壁式生物反应器 u中空纤维生物反应器中空纤维生物反应器 u灌流式生物反应器灌流式生物反应器 2021/3/11 42 n血管生物反应器主要由两部分组成，即反应血管生物反应器主要由两部分组成，即反应 器部分和控制系统部分，反应器部分由培养器部分和控制系统部分，反应器部分由培养 室、