PCR技术[沐风书苑]

1、生物化学实验技术 1业内优讲 业内优讲 多聚酶链式反应多聚酶链式反应 PCR是由美国科学家是由美国科学家 业内优讲 体内体内DNADNA的复制体系的复制体系 业内优讲 引物引物 引物引物 业内优讲 () 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 耐热耐热DNADNA聚合酶聚合酶 Saiki（1988）将耐热）将耐热DNA聚合酶引入聚合酶引入PCR，使利用热变性解链，使利用热变性解链DNA模板可行。模板可行。 业内优讲 PCR反应循环反应循环 业内优讲 业内优讲 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2+ 模板：模板：DNA 引物：引物：P1 P2 DNA

2、聚合酶：聚合酶：Taq 原料：原料：dNTP 反应缓冲液反应缓冲液 辅助因子：辅助因子：Mg2+ 业内优讲 单、双链单、双链DNADNA均可。均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNADNA聚合酶抑制剂、聚合酶抑制剂、DNADNA 结合蛋白类。结合蛋白类。 DNADNA模板一般模板一般100ng /100100ng /100 L L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 业内优讲 0.1-0.5 0.1-0.5 mol/Lmol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配, ,反应特异性下降。反应特异性下降。 0.

3、5-2.5 U/50 0.5-2.5 U/50 l l 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降; ;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。 业内优讲 dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTPdNTP浓度应相等浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入浓度过高易产生错误碱基的掺入, ,浓度过低则降浓度过低则降 低反应产量低反应产量 dNTPdNTP可与可与Mg2+Mg2+结合结合, ,使游离的使游离的Mg2+Mg2+浓度下降浓度下降, ,影响影响 DNADNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 业内优讲 Mg2+Mg2+是是DNADNA聚合酶的激

4、活剂。适宜浓度为聚合酶的激活剂。适宜浓度为0.5-0.5- 2.5mmol/L2.5mmol/L反应体系。反应体系。 Mg2+Mg2+浓度过低会使浓度过低会使TaqTaq酶活性丧失、酶活性丧失、PCRPCR产量下降；产量下降； Mg2+Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。 Mg2+Mg2+可与负离子结合可与负离子结合, ,所以反应体系中所以反应体系中dNTPdNTP、EDTAEDTA 等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2+Mg2+浓度。浓度。 业内优讲 使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链 9494， 20-3020-30秒秒 温度由引物长度和温度由引物长

5、度和GCGC含量决定。含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; ;降降 低温度可增加反应的灵敏性。低温度可增加反应的灵敏性。 业内优讲 70-75,70-75,一般为一般为7272 延伸时间由扩增片段长度决定延伸时间由扩增片段长度决定 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度 一般为一般为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加错误掺入率增加 业内优讲 扩增量达扩增量达230230个拷贝（个拷贝（109109拷贝）拷贝） PCRPCR产物每轮循环增加一倍产物每轮循环增加一倍 业内优讲 引

6、物的序列及其与模板结合的特异性是决定引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCRPCR反反 应结果的关键。应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和 特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 业内优讲 业内优讲 利用利用PCRPCR扩增扩增, ,只需要数小时只需要数小时, ,就可以扩增出就可以扩增出 可用可用 电泳法检出的电泳法检出的DNADNA，可用于检测基因组中仅含数个拷，可用于检测基因组中仅含数个拷 贝的模板序列。贝的模板序列。 业内优讲 PCR示例示例 一、实验目的一、实验目的 学习学习PCR

7、PCR分析的原理与技术。分析的原理与技术。 业内优讲 1 1、材料：含、材料：含1Kb1Kb插入片段的克隆载体插入片段的克隆载体Pmd18-Pmd18- T T 质粒质粒DNADNA 2 2、仪器：微量移液器及吸头、仪器：微量移液器及吸头、PCRPCR仪及仪及PCRPCR 管管 琼脂糖凝胶电泳设备琼脂糖凝胶电泳设备 3 3、试剂：、试剂：1010X XPCRPCR 反应缓冲液反应缓冲液 25mmol/L MgCl25mmol/L MgCl2 2 10mmol/L dNTP 10mmol/L dNTP 10 10mol/L mol/L 引物引物1 1和引物和引物2 2 二、实验材料、仪器和二、实

8、验材料、仪器和试剂试剂 业内优讲 1.1.按照如下体积向按照如下体积向PCRPCR管中按顺序加入各试管中按顺序加入各试 剂剂 并混匀：并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1 L(5U) 水补充至 25.0 L 三、操作步骤三、操作步骤 业内优讲 2.2.按照如下体积向按照如下体积向PCRPCR管中按顺序加入各试管中按顺序加入各试 剂剂 并混匀：并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 L 25mmol/L MgCl2 2.0L 10mmol/L dNTP 1.0 L 10mol/L 引物1 1.0 L 10mol/L引物2 1.0L 质粒DNA 1.0 L Taq 0.1