仪器分析师进修课件-高效液相色谱法与液相色谱仪

1、 第十六章第十六章 高效液相色谱法与液相色谱仪高效液相色谱法与液相色谱仪 2021-8-6 内容：内容： 一、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的特点 二、流程及主要部件二、流程及主要部件 三、影响分离的因素三、影响分离的因素 四、高效液相色谱法的主要四、高效液相色谱法的主要 分离类型分离类型 概述概述 高效液相色谱法（高效液相色谱法（HPLCHPLC）是是2020世纪世纪6060 年代末年代末7070年代初发展起来的一种新型分离年代初发展起来的一种新型分离 分析技术，随着不断改进与发展，目前已分析技术，随着不断改进与发展，目前已 成为应用极为广泛的化学分离分析的重要成为应用极为广泛的化学

2、分离分析的重要 手段。手段。 一、液相色谱分离原理及分类一、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也和气相色谱一样，液相色谱分离系统也 由两相由两相固定相和流动相组成。固定相和流动相组成。液相液相 色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合色谱的固定相可以是吸附剂、化学键合 固定相（或在惰性载体表面涂上一层液固定相（或在惰性载体表面涂上一层液 膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流；流 动相是各种溶剂。动相是各种溶剂。 被分离混合物由流动相液体推动进被分离混合物由流动相液体推动进 入色谱柱。根据入色谱柱。根据各组分在固定相及流动各组分在固定相及流动 相中的吸

3、附能力、分配系数、离子交换相中的吸附能力、分配系数、离子交换 作用或分子尺寸大小的差异进行分离。作用或分子尺寸大小的差异进行分离。 色谱分离的实质色谱分离的实质是样品分子（以下称是样品分子（以下称 溶质）与溶溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以剂（即流动相或洗脱液）以 及固定相分子间的作用，作用力的大小，及固定相分子间的作用，作用力的大小， 决定色谱过程的保留行为。决定色谱过程的保留行为。 根据分离机制不同，液相色谱可分根据分离机制不同，液相色谱可分 为：为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化液固吸附色谱、液液分配色谱、化 合键合色谱、离子交换色谱以及分子排合键合色谱、离子交换色谱以及分子排 阻色谱

4、等类型阻色谱等类型。 它是在经典液相色谱基础上，引入了气它是在经典液相色谱基础上，引入了气 相色谱的理论，相色谱的理论，在技术上在技术上采用了高压泵、采用了高压泵、 高效固定相和高灵敏度检测器，因而具高效固定相和高灵敏度检测器，因而具 备备速度快、效率高、灵敏度高、操作自速度快、效率高、灵敏度高、操作自 动化的特点动化的特点。为了更好地了解高效液相。为了更好地了解高效液相 色谱法优越性，现从两方面进行比较：色谱法优越性，现从两方面进行比较： 高效液相色谱法比起经典液相色谱高效液相色谱法比起经典液相色谱 法的最大优点在于法的最大优点在于高速、高效、高灵敏高速、高效、高灵敏 度、高自动化度、高自动

5、化。高速是指在分析速度上。高速是指在分析速度上 比经典液相色谱法快数百倍。由于经典比经典液相色谱法快数百倍。由于经典 色谱是重力加料，流出速度极慢；而高色谱是重力加料，流出速度极慢；而高 效液相色谱配备了高压输液设备，流速效液相色谱配备了高压输液设备，流速 最高可达最高可达 103cmmin-1。 高效液相色谱法与经典液相色谱法高效液相色谱法与经典液相色谱法 例如分离苯的羟基化合物，例如分离苯的羟基化合物，7个组分个组分 只需只需1min就可完成。就可完成。 对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约 170cm，柱径柱径0.9cm，流动相速度为流动相速度为 30cm

6、3h-1，需用需用20多小时才能多小时才能分离出分离出20 种氨基酸；而用高效液相色谱法，种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需只需 lh之内即可完成。之内即可完成。 又如用又如用25cm 0.46 cm 的的Lichrosorb ODS(5)的柱，采用梯度洗脱，可在的柱，采用梯度洗脱，可在 不到不到0.5h内分离出尿中内分离出尿中104个组分。个组分。 （l l）气相色谱法气相色谱法分析对象分析对象只限于分只限于分 析气体和沸点较低的化合物，它们仅占析气体和沸点较低的化合物，它们仅占 有机物总数的有机物总数的2020。对于占有机物总数。对于占有机物总数 近近8080的那些高沸点、热稳定性差、摩的

7、那些高沸点、热稳定性差、摩 尔质量大的物质，目前主要采用高效液尔质量大的物质，目前主要采用高效液 相色谱法进行分离和分析。相色谱法进行分离和分析。 高效液相色谱法与气相色谱法高效液相色谱法与气相色谱法 （2）液相色谱能完成难度较高的分离）液相色谱能完成难度较高的分离 工作，因为：工作，因为： 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，气相色谱的流动相载气是色谱惰性的， 不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和 作用，样品分子只与固定相相互作用。作用，样品分子只与固定相相互作用。而而 在液相色谱中，流动相液体也与固定相争在液相色谱中，流动相液体也与固定相争 夺样品分子，为

8、提高选择性增加了一个因夺样品分子，为提高选择性增加了一个因 素素。也可选用不同比例的两种或两种以上。也可选用不同比例的两种或两种以上 的液体作流动相，增大分离的选择性。的液体作流动相，增大分离的选择性。 液相色谱固定相类型多，如离子交换色液相色谱固定相类型多，如离子交换色 谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余谱和排阻色谱。等，作为分析时选择余 地大；而气相色谱并不可能的。地大；而气相色谱并不可能的。 液相色谱通常在室温下操作，较低的液相色谱通常在室温下操作，较低的 温度，一般有利于色谱分离条件的选择。温度，一般有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小）由于液体的扩散性比气体的

9、小 105倍，因此，溶质在液相中的传质速率倍，因此，溶质在液相中的传质速率 慢，柱外效应就显得特别重要；而在气慢，柱外效应就显得特别重要；而在气 相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收）液相色谱中制备样品简单，回收 样品也比较容易，样品也比较容易，而且回收是定量的，而且回收是定量的， 适合于大量制备适合于大量制备。但液相色谱尚缺乏通。但液相色谱尚缺乏通 用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。 在实际应用中，这两种色谱技术是互相在实际应用中，这两种色谱技术是互相 补充的。补充的。 目前高效液相

10、色谱法已被广泛目前高效液相色谱法已被广泛 应用于分析对生物学和医药上有重应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大意义的大分子物质大分子物质，例如蛋白质、，例如蛋白质、 核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、 高聚物、染料及高聚物、染料及药物等药物等物质的分离物质的分离 和分析。和分析。 高效液相色谱法的仪器设备费高效液相色谱法的仪器设备费 用昂贵，操作严格，这是它的主要用昂贵，操作严格，这是它的主要 缺点缺点。 高效液相色谱仪的结构示意见高效液相色谱仪的结构示意见 图图20-1，一般可分为，一般可分为4个主要部分：个主要部分： 高压输液系统，进样系统，分离系高压输液

11、系统，进样系统，分离系 统和检测系统统和检测系统。此外还配有。此外还配有辅助装辅助装 置置：如梯度淋洗，自动进样及数据：如梯度淋洗，自动进样及数据 处理等。处理等。 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 其其工作过程工作过程如下：如下：首先首先高压泵高压泵 将贮液器中流动相溶剂经过进样器将贮液器中流动相溶剂经过进样器 送入色谱柱，送入色谱柱，然后然后从控制器的出口从控制器的出口 流出。当注入欲分离的样品时，流流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同经进样器贮液器的流动相将样品同 时带入色谱柱进行分离，然后依先时带入色谱柱进行分离，然后依先 后顺序进入检测器，记录仪将检测后顺序进入

12、检测器，记录仪将检测 器送出的信号记录下来，由此得到器送出的信号记录下来，由此得到 液相色谱图。液相色谱图。 高效液相色谱仪高效液相色谱仪1 1 高效液相色谱仪高效液相色谱仪2 高效液相色谱仪高效液相色谱仪3 3 高效液相色谱仪高效液相色谱仪4 4 一、高效液相色谱法的特点一、高效液相色谱法的特点 1.1.流程流程 二、流程及主要部件二、流程及主要部件 2. 主要部件：主要部件： （1 1）高压输液泵）高压输液泵： 主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：15015035035010105 5 PaPa 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调 、 耐腐蚀等特性

13、。耐腐蚀等特性。 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极由于高效液相色谱所用固定相颗粒极 细，因此对流动相阻力很大，为使流动相细，因此对流动相阻力很大，为使流动相 较快流动，必须配备有高压输液系统。它较快流动，必须配备有高压输液系统。它 是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由 储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动 阻力器等组成阻力器等组成，其中，其中高压输液泵是核心部高压输液泵是核心部 件件。 对于一个好的高压输液泵应符合密对于一个好的高压输液泵应符合密 封性好，输出流量恒定，压力平稳，可封性好，输出流量恒定，压力平稳，可 调范围

14、宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀 等要求。等要求。 常用的输液泵分为常用的输液泵分为恒流泵恒流泵和和恒压泵恒压泵两种。两种。 恒流泵恒流泵特点是在一定操作条件下，输特点是在一定操作条件下，输 出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化 无关；无关； 恒压泵恒压泵是指能保持输出压力恒定，但是指能保持输出压力恒定，但 其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留 时间的重视性差，它们各有优缺点。时间的重视性差，它们各有优缺点。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又 称机械泵，

15、它又分称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复机械注射泵和机械往复 泵泵两种，应用最多的是两种，应用最多的是机械往复泵机械往复泵。 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多 （约（约5 53030cmcm），），所以所以柱外展宽（又称柱外柱外展宽（又称柱外 效应）较突出效应）较突出。 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起 的峰展宽，的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道主要包括进样系统、连接管道 及检测器中存在死体积及检测器中存在死体积。 柱外展宽可分柱外展宽可分柱前柱前和和柱后柱后展宽。进样展宽。进样 系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高系统是引

16、起柱前展宽的主要因素，因此高 效液相色谱法中对进样技术要求较严。效液相色谱法中对进样技术要求较严。 （2 2）进样系统）进样系统 流路中为高压力工作状态，通常使用耐流路中为高压力工作状态，通常使用耐 高压的六通阀进样装置，高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：其结构如图所示： 进样装置进样装置 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包 括括柱管柱管与与固定相固定相两部分。柱管材料有玻璃、两部分。柱管材料有玻璃、 不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其不锈钢、铝、铜及内衬光滑聚合材料的其 他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得 较多。较多

17、。一般色谱柱长一般色谱柱长5 53030cmcm，内径为内径为4 4 5 5mmmm，凝胶色谱柱内径凝胶色谱柱内径3 31212mmmm，制备柱内制备柱内 径较大，可达径较大，可达2525mm mm 以上。以上。 （3 3）分离系统）分离系统色谱柱色谱柱 一般在分离前备有一个一般在分离前备有一个前置柱前置柱，前，前 置柱内填充物和分离柱完全一样，这样置柱内填充物和分离柱完全一样，这样 可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的 固定相饱和，使它在流过分离柱时不再固定相饱和，使它在流过分离柱时不再 洗脱其中固定相，保证分离技的性能不洗脱其中固定相，保证分离技的性能不 受

18、影响。受影响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。柱子装填得好坏对柱效影响很大。 对于细粒度的填料（对于细粒度的填料（20m）一般采一般采 用用匀浆填充法装柱匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，先将填料调成匀浆， 然后在高压泵作用下，快速将其压入装然后在高压泵作用下，快速将其压入装 有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可 备用。备用。 柱体为直型不锈钢管，柱体为直型不锈钢管，发展趋势发展趋势是减小填是减小填 料粒度和柱径以提高柱效。料粒度和柱径以提高柱效。 高效分离柱高效分离柱 作用作用 用来连续监测经色谱柱分离后用来连续监测经色谱柱分离后 的流出物的组成和含量变化的装

19、置。的流出物的组成和含量变化的装置。 在液相色谱中，有两种基本类型的在液相色谱中，有两种基本类型的 检测器。一类是检测器。一类是溶质性检测器溶质性检测器，它仅对，它仅对 被分离组分的物理或化学特性有响应，被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有属于这类检测器的有紫外、荧光、电化紫外、荧光、电化 学检测器学检测器等。等。 （4 4）检测系统）检测系统 另一类是另一类是总体检测器总体检测器，它对试它对试 样和洗脱液总的物理或化学性质有样和洗脱液总的物理或化学性质有 响应，属于这类检测器的有响应，属于这类检测器的有示差折示差折 光，电导检测器光，电导检测器等。等。 现将常用的检测器介绍

20、如下现将常用的检测器介绍如下: : 目前最常用的检测器主要有：目前最常用的检测器主要有： 紫外紫外-可见检测器可见检测器 荧光检测器荧光检测器 电化学检测器电化学检测器 蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 质谱检测器质谱检测器 v1.1.紫外紫外- -可见检测器可见检测器 检测室检测室 光源光源 光栅光栅 二极管阵二极管阵 列检测器列检测器 紫外光度检测器（紫外光度检测器（UV）：）：最小检测最小检测 量量10-9gmL-1，对流量和温度的波动不敏对流量和温度的波动不敏 感，可用于梯度洗脱。感，可用于梯度洗脱。 v2.荧光检测器荧光检测器 许多有机化合物，特别是芳香族化合许多有机化合物，特别是芳

21、香族化合 物、被一定强度和波长的紫外光照射后，物、被一定强度和波长的紫外光照射后， 发射出较激发光波长要长的荧光。发射出较激发光波长要长的荧光。 特点特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择有非常高的灵敏度和良好的选择 性，灵敏度要比紫外检测法高性，灵敏度要比紫外检测法高2 3个数量级，个数量级， 特别适合于药物和生物化学样品的分析。特别适合于药物和生物化学样品的分析。 荧光检测器结构示意图荧光检测器结构示意图 光源光源 检测检测 器器 滤光片滤光片 检测室检测室 v3.3.蒸发光散射检测器蒸发光散射检测器 蒸发光散射检测器适合于无紫外吸蒸发光散射检测器适合于无紫外吸 收、无电活性和不发荧光的样品

22、的检测。收、无电活性和不发荧光的样品的检测。 v4.4.电化学检测器（电化学检测器（以电导检测器为例以电导检测器为例） 电导仪电导仪 电极电极 电极电极 问题问题 电导检测器怎样消除流动相电电导检测器怎样消除流动相电 导的干扰？导的干扰？ 例如，采用阳离子交换色谱分例如，采用阳离子交换色谱分 离碱金属离子时，通常用离碱金属离子时，通常用HCl作为作为 流动相。流动相。 v 5.5.示差折光率检测器示差折光率检测器 几乎所有物质都有各自不同的折射率，几乎所有物质都有各自不同的折射率， 因此差示折光检测器是一种因此差示折光检测器是一种通用型通用型检测器。检测器。 灵敏度可达灵敏度可达1010-7

23、-7g gcm cm-3 -3。 。主要主要缺点缺点是对温度是对温度 变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。变化敏感，并且不能用于梯度淋洗。 (5)(5)附属系统附属系统 它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自它包括脱气、梯度淋洗、恒温、自 动进样、馏分收集以及数据处理等装置。动进样、馏分收集以及数据处理等装置。 其中其中梯度淋洗装置梯度淋洗装置是高压液相色谱仪中是高压液相色谱仪中 尤为重要的附属装置。尤为重要的附属装置。 梯度洗脱装置梯度洗脱装置 梯度洗脱梯度洗脱就是在分离过程中使就是在分离过程中使 两种或两种以上不同极性的溶剂按两种或两种以上不同极性的溶剂按 一定程序连续改变它们之间的比例，一定程序连续

24、改变它们之间的比例， 从而使流动相的强度、极性、从而使流动相的强度、极性、pHpH值值 或离子强度相应地变化，达到提高或离子强度相应地变化，达到提高 分离效果，缩短分析时间的目的。分离效果，缩短分析时间的目的。 梯度洗脱装置分为梯度洗脱装置分为两类两类： 一类是一类是外梯度装置外梯度装置（又称低压梯（又称低压梯 度），流动相在常温常压下混合，用度），流动相在常温常压下混合，用 高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是另一类是内梯度装置内梯度装置（又称高压（又称高压 梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，梯度），将两种溶剂分别用泵增压后， 按电器部件设置的程序，

25、注入梯度混按电器部件设置的程序，注入梯度混 合室混合，再输至柱系统。合室混合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动是通过不断地变化流动 相的强度，来调整混合样品中各组分的相的强度，来调整混合样品中各组分的k k 值，使所有谱带都以最佳平均值，使所有谱带都以最佳平均k k值通过色值通过色 谱柱。谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当它在液相色谱中所起的作用相当 于气相色谱中的程序升温于气相色谱中的程序升温。所不同的是，。所不同的是， 在梯度洗脱中溶质在梯度洗脱中溶质k k值的变化是通过溶质值的变化是通过溶质 的极性、的极性、pHpH值和离子强度来实现的，而值和离子强度来实

26、现的，而 不是借改变温度（温度程序）来达到不是借改变温度（温度程序）来达到。 在线脱气装置在线脱气装置 在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解在线脱气装置用于脱去流动相中的溶解 气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱气体，流动相先经过脱气装置再输送到色谱 柱。柱。 除在线脱气装置外，目前也采用超声脱除在线脱气装置外，目前也采用超声脱 气、真空脱气等方式。气、真空脱气等方式。 脱气不好时有气泡，导致流动相流速脱气不好时有气泡，导致流动相流速 不稳定，造成基线飘移，噪音增加。不稳定，造成基线飘移，噪音增加。 在高效液相色谱中在高效液相色谱中, 速率方程中的分子速率方程中的分子 扩散项扩散项B/U较小，

27、可以忽略不计，而只有两较小，可以忽略不计，而只有两 项，即：项，即： H = A + C u 故液相色谱故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不曲线与气相色谱的形状不 同，如图所示：同，如图所示： 影响分离的主要因素影响分离的主要因素有流动相的流量、有流动相的流量、 性质和极性。性质和极性。 三、影响分离的因素三、影响分离的因素 流速：流速：流速大于流速大于0.5 cm/s时时, Hu曲线是一曲线是一 段斜率不大的直线。降段斜率不大的直线。降 低流速，柱效提高不是低流速，柱效提高不是 很大。但在实际操作中，很大。但在实际操作中， 流量仍是一个调整分离流量仍是一个调整分离 度和出峰时间的重要可度和

28、出峰时间的重要可 选择参数。选择参数。 影响分离的因素影响分离的因素 固定相及分离柱固定相及分离柱：气相色谱中的固：气相色谱中的固 定液原则上都可以用于液相色谱，其选定液原则上都可以用于液相色谱，其选 用原则与气相色谱一样。但在高效液相用原则与气相色谱一样。但在高效液相 色谱中，分离柱的制备是一项技术要求色谱中，分离柱的制备是一项技术要求 非常高的工作，一般很少自行制备非常高的工作，一般很少自行制备。 高效液相色谱的固定相和流动相高效液相色谱的固定相和流动相 （）固定相（）固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能高效液相色谱固定相以承受高压能 力来分类，可分为力来分类，可分为刚性固体和硬胶刚性固

29、体和硬胶两大两大 类。刚性固体以类。刚性固体以二氧化硅为基质二氧化硅为基质，可承，可承 受受7.7.O O10108 81.O1.O10109 9PaPa的高压，可制成的高压，可制成 直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果 在二氧化硅表面键合各种官能团，就是在二氧化硅表面键合各种官能团，就是 键合固定相，可扩大应用范围，它是目键合固定相，可扩大应用范围，它是目 前最广泛使用的一种固定相。前最广泛使用的一种固定相。 硬胶硬胶主要用于离子交换和尺主要用于离子交换和尺 寸排阻色谱中，它由寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯聚苯乙烯与与 二乙烯苯基二乙烯苯基交联而成。可承受压交联而

30、成。可承受压 力上限为力上限为3.5108Pa。固定相按固定相按 孔隙深度分类，可分为孔隙深度分类，可分为表面多孔表面多孔 型型和和全多孔型固定相全多孔型固定相两类。两类。 1. 1. 1.表面多孔型固定相表面多孔型固定相表面多孔型固定相表面多孔型固定相表面多孔型固定相表面多孔型固定相 它的它的基体基体是实心是实心玻璃珠玻璃珠，在玻璃球外面，在玻璃球外面 覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化铝、 离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。 表面活性材料表面活性材料为为氧化铝氧化铝的固定相，这类的固定相，这类 固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对

31、死体积固定相的多孔层厚度小、孔浅，相对死体积 小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透 性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡， 较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄，最 大允许量受限制。大允许量受限制。 2 2 2全多孔型固定相全多孔型固定相全多孔型固定相全多孔型固定相全多孔型固定相全多孔型固定相 它由它由直径为直径为10nm的硅胶微粒凝的硅胶微粒凝 聚聚而成。也可由而成。也可由氧化铝微粒凝聚氧化铝微粒凝聚成成 全多孔型固定相，全多孔型固定相， 这类固定相由于这类固定相由于 颗粒很

32、细（颗粒很细（510m），），孔仍然较孔仍然较 浅，传质速率快，易实现高效、高浅，传质速率快，易实现高效、高 速。特别适合复杂混合物分离及痕速。特别适合复杂混合物分离及痕 量分析。量分析。 vvv流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性流动相及流动相的极性 （1 1）可显著改变组分分离状况的流动相）可显著改变组分分离状况的流动相 选择在液相色谱中显得特别重要。选择在液相色谱中显得特别重要。 液相色液相色 谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。 （2 2）亲水性固定液常采用疏水性流动相）亲水性固定液常采用疏水

33、性流动相 ，即流动相的极性小于固定相的极性，称，即流动相的极性小于固定相的极性，称 为为正相液液色谱法正相液液色谱法，极性柱也称，极性柱也称正相柱正相柱。 （3 3）若流动相的极性大于固定液的）若流动相的极性大于固定液的 极性，则称为极性，则称为反相液液色谱反相液液色谱，非极，非极 性柱也称为性柱也称为反相柱反相柱。组分在两种类。组分在两种类 型分离柱上的出峰顺序相反。型分离柱上的出峰顺序相反。 vvv流动相组成流动相组成流动相组成流动相组成流动相组成流动相组成 流动相按组成不同可分为流动相按组成不同可分为单组分和多组分；单组分和多组分； 按极性可分为按极性可分为极性、弱极性、非极性；极性、弱

34、极性、非极性； 按使用方式有按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗。固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂常用溶剂: : 烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯 、乙醇、乙腈、水。、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可采用二元或多元组合溶剂作为流动相可 以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以 改进分离或调整出峰时间。改进分离或调整出峰时间。 （二）流动相（二）流动相（二）流动相（二）流动相（二）流动相（二）流动相 由于高效液相色谱中流动相是液体，由于高效液相色谱中流动相是液体， 它对组分有亲和力，并参与固定相对组分它对组分有亲和力

35、，并参与固定相对组分 的竞争。因此，正确选择流动相直接影响的竞争。因此，正确选择流动相直接影响 组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： （1 1）溶剂对于待测样品，必须具有合适的溶剂对于待测样品，必须具有合适的 极性和良好的选择性。极性和良好的选择性。 （2 2）溶剂要与检测器匹配。溶剂要与检测器匹配。 2021-8-6 （3 3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流 动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引 起基线不稳，或产生起基线不稳，或产生“伪峰伪峰”。痕量杂质的。痕量杂质的 存在，将使

36、截止波长值增加存在，将使截止波长值增加501OOnm。 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应化学稳定性好。不能选与样品发生反应 或聚合的溶剂。或聚合的溶剂。 （5 5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高 压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙压力，不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙 酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也酮、乙醇、乙晴等。但粘度过于低的溶剂也 不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱 柱或检测器内形成气泡，影响分离。柱或检测器内形成气泡，影响分离。 对于紫外吸收检测器，应对于紫外吸收检测器，应注意选用检注意

37、选用检 测器波长比溶剂的紫外截止波长要长测器波长比溶剂的紫外截止波长要长。 所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波所谓溶剂的紫外截止波长指当小于截止波 长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生长的辐射通过溶剂时，溶剂对此辐射产生 强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明强烈吸收，此时溶剂被看作是光学不透明 的，它严重干扰组分的吸收测量。表的，它严重干扰组分的吸收测量。表20-220-2 列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。列出了一些常用溶剂的紫外截止波长。 对于折光率检测器，要求选择与组分对于折光率检测器，要求选择与组分 折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达折光率有较大差别的溶剂作流动相，以达 最高灵敏度

38、。最高灵敏度。 高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型高效液相色谱法的主要分离类型 1.1.吸附色谱（液吸附色谱（液- -固吸附色谱）固吸附色谱）：以固体吸附：以固体吸附 剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用 的是的是5 51010mm的硅胶吸附剂。流动相可以是的硅胶吸附剂。流动相可以是 各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。 2.2.分配色谱（液分配色谱（液- -液分配色谱）液分配色谱）：早期通过在：早期通过在 担体上涂渍一薄层固

39、定液制备固定相担体上涂渍一薄层固定液制备固定相, , 现现 多为化学键合固定相，即用化学反应的方法多为化学键合固定相，即用化学反应的方法 通过化学键将固定液结合在担体表面。通过化学键将固定液结合在担体表面。 3.3.离子交换色谱离子交换色谱：固定相为离子交换树脂：固定相为离子交换树脂 ，流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各流动相为无机酸或无机碱的水溶液。各 种离子根据它们与树脂上的交换基团的交种离子根据它们与树脂上的交换基团的交 换能力的不同而得到分离。换能力的不同而得到分离。 4.4.凝胶色谱（空间排阻色谱）凝胶色谱（空间排阻色谱）：以凝胶为：以凝胶为 固定相。凝胶是一种经过交联的、具有立固定

40、相。凝胶是一种经过交联的、具有立 体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。体网状结构和不同孔径的多聚体的通称。 如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔如葡聚糖凝胶、琼脂糖等软质凝胶；多孔 硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；硅胶、聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶； 高效液相色谱法的高效液相色谱法的高效液相色谱法的 主要类型及选择主要类型及选择主要类型及选择 （）液一液分配色谱法（）液一液分配色谱法（LLPC） 在液在液-液色谱中液色谱中,流动相和固定相都是流动相和固定相都是 液体液体,它能适用于各种样品类型的分离和它能适用于各种样品类型的分离和 分析，无论是极性的和非极性的，水溶分析，无论是极性的和非极性的，水溶

41、性和油溶性的，离子型的和非离子型的性和油溶性的，离子型的和非离子型的 化合物。化合物。 1. 1.分离原理分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液液液分配色谱的分离原理基本与液液 萃取相同，都是萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶根据物质在两种互不相溶 的液体中溶解度的不同，具有不同的分配的液体中溶解度的不同，具有不同的分配 系数。系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱所不同的是液液色谱的分配是在柱 中进行的，使这种分配平衡可反复多次进中进行的，使这种分配平衡可反复多次进 行，造成各组分的差速迁移，提高了分离行，造成各组分的差速迁移，提高了分离 效率，从而能分离各种复杂组分。效率，从而能分离各

42、种复杂组分。 2.固定相固定相 由于液液色谱中流动相参与选择竞由于液液色谱中流动相参与选择竞 争，因此，对固定相选择较简单。只需争，因此，对固定相选择较简单。只需 使用几种极性不同的固定液即可解决分使用几种极性不同的固定液即可解决分 离问题。离问题。 例如，最常用的例如，最常用的强极性强极性固定液固定液， 一氧二丙睛，一氧二丙睛，中等极性中等极性的聚乙二醇，的聚乙二醇，非非 极性极性的角鲨烷等。的角鲨烷等。 3. 3.流动相流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失。在液液色谱中为了避免固定液的流失。 对流动相的一个基本要求是流动相尽可对流动相的一个基本要求是流动相尽可 能不与固定相互溶，而且能

43、不与固定相互溶，而且流动相与固定流动相与固定 相的极性差别越显著越好相的极性差别越显著越好。根据所使用。根据所使用 的流动相和固定相的极性程度，将其分的流动相和固定相的极性程度，将其分 为为正相分配色谱和反相分配色谱正相分配色谱和反相分配色谱。 如果采用如果采用流动相的极性小于固定相的流动相的极性小于固定相的 极性，称为正相分配色谱极性，称为正相分配色谱，它适用于极性，它适用于极性 化合物的分离。其化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出顺序是极性小的先 流出，极性大的后流出流出，极性大的后流出。 如果采用如果采用流动相的极性大于固定相的流动相的极性大于固定相的 极性，称为反相分配色谱极性，称

44、为反相分配色谱。它适用于非极。它适用于非极 性化合物的分离，性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱其流出顺序与正相色谱 恰好相反恰好相反。 为了更好解决固定液在载体上流失问题。为了更好解决固定液在载体上流失问题。 产生了产生了化学键合固定相化学键合固定相。它是将各种不同。它是将各种不同 有机基团通过化学反应键合到载体表面的有机基团通过化学反应键合到载体表面的 一种方法。它代替了固定液的机械涂渍，一种方法。它代替了固定液的机械涂渍， 因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着 重大作用，重大作用，可以认为它的出现是液相色谱可以认为它的出现是液相色谱 法的一个重大突破法

45、的一个重大突破。它是目前应用最广泛。它是目前应用最广泛 的一种固定相。据统计，约有的一种固定相。据统计，约有3/43/4以上的分以上的分 离问题是在化学键合固定相上进行的。离问题是在化学键合固定相上进行的。 （二）化学键合相色谱法（二）化学键合相色谱法（二）化学键合相色谱法（二）化学键合相色谱法（二）化学键合相色谱法（二）化学键合相色谱法（CBPCCBPCCBPC） 采用化学键合相的液相色谱称为化学采用化学键合相的液相色谱称为化学 键合相色谱法，键合相色谱法，简称键合相色谱。由于键合简称键合相色谱。由于键合 固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用固定相非常稳定，在使用中不易流失，适用 于梯度淋

46、洗，特别适用于于梯度淋洗，特别适用于分离容量因子分离容量因子k值值 范围宽范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能的样品。由于键合到载体表面的官能 团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁团可以是各种极性的，因此它适用于种类繁 多样品的分离。多样品的分离。 1.键合固定相类型键合固定相类型 用来制备键合固定相的载体，几乎都用来制备键合固定相的载体，几乎都 用用硅胶硅胶。利用硅胶表面的硅醇基。利用硅胶表面的硅醇基(Si一一OH) 与有机分可成键与有机分可成键,即可得到各种性能的固即可得到各种性能的固 定相。一般可分定相。一般可分三类三类 （1）疏水基团疏水基团 如不同链长的烷烃（如不同链长的烷烃（C

47、8和和C18）和和 苯基等；苯基等； （2）极性基团极性基团 如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；如氨丙基，氰乙基、醚和醇等； （3）离子交换基团离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺如作为阴离子交换基团的胺 基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。基，季铵盐；作为阳离子交换基团的磺酸等。 2.键合固定相的制备键合固定相的制备 （l）硅酸酯（硅酸酯（Si一一OR）键合固定相键合固定相,它是它是 最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与最先用于液相色谱的健合固定相。用醇与 硅醇基发生酯化反应：硅醇基发生酯化反应： Si0HROHSiORH20 由于这类键合固定相的有机表面是一些单由于这类键合固定相的有机表面

48、是一些单 体，具有良好的传质特性体，具有良好的传质特性,但这些酯化过的但这些酯化过的 硅胶填料易水解且受热不稳定，因此硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适仅适 用于不含水或醇的流动相。用于不含水或醇的流动相。 （2）SiC或或Si一一N共价键合固定相共价键合固定相 制备反应如下：制备反应如下： OHSiSOCl2 ClSi + HgBr Si SiNHCH2CHNH2 H2NCH2CH2NH2 共价键健合固定相不易水解，并共价键健合固定相不易水解，并 且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏且热稳定较硅酸酯好。缺点是格氏 反应不方便；当使用水溶液时，反应不方便；当使用水溶液时，必必 须限制须限制pHpH

49、在在4 48 8范围内。范围内。 （3）硅烷化（硅烷化（SiOSiC）键合固定相键合固定相 制备反应如下：制备反应如下： OHSiClSiR3 + SiO (ROSiR3) SiR3+ HCl 这类键会固定相具有热稳定好，不易这类键会固定相具有热稳定好，不易 吸水，耐有机溶剂的优点。能在吸水，耐有机溶剂的优点。能在70以下，以下， pH=28范围内正常工作，应用较广泛。范围内正常工作，应用较广泛。 3 3 3反相键合相色谱法反相键合相色谱法反相键合相色谱法反相键合相色谱法反相键合相色谱法反相键合相色谱法 此法的固定相是采用极性较小的键此法的固定相是采用极性较小的键 合固定相，如合固定相，如硅胶

50、一硅胶一C18H37、硅胶一苯基硅胶一苯基 等；等；流动相是采用极性较强的溶剂，如流动相是采用极性较强的溶剂，如 甲醇、乙睛一水、水和无机盐的缓冲溶甲醇、乙睛一水、水和无机盐的缓冲溶 液液等。它多用于分离多环芳烃等低极性等。它多用于分离多环芳烃等低极性 化合物；化合物； 若采用若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水含一定比例的甲醇或乙睛的水 溶液为流动相溶液为流动相，也可用于分离极性化合物；，也可用于分离极性化合物； 若采用若采用水和无机盐的缓冲液为流动相水和无机盐的缓冲液为流动相，则，则 可分离一些易离解的样品，如有机酸、有可分离一些易离解的样品，如有机酸、有 机碱、酚类等。机碱、酚类等。 反相键

51、合相色谱法具有柱效高，能获反相键合相色谱法具有柱效高，能获 得无拖尾色谱峰的得无拖尾色谱峰的优点优点。 关于反相键合相色谱的分离机理，可关于反相键合相色谱的分离机理，可 用所谓用所谓疏溶剂作用理论来解释疏溶剂作用理论来解释。这种理论。这种理论 把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅把非极性的烷基键合相看作一层键合在硅 胶表面上的十八烷基的胶表面上的十八烷基的“分子毛分子毛”，这种，这种 “分子毛分子毛”有较强的疏水特性。当用极性有较强的疏水特性。当用极性 溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有溶剂为流动相来分离含有极性官能团的有 机化合物时：机化合物时： 一方面一方面，分子中的非极性部分与固定相，

52、分子中的非极性部分与固定相 表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它 保留在固定相中；保留在固定相中； 而而另一方面另一方面，被分离物的极性部分受到，被分离物的极性部分受到 极性流动相的作用，促使它离开固定相，极性流动相的作用，促使它离开固定相， 并减小其保留作用（见图并减小其保留作用（见图20-420-4）。显然）。显然， 两种作用力之差，决定了分子在色谱中两种作用力之差，决定了分子在色谱中 的保留行为的保留行为。 4. 4. 4.正相键合相色谱法正相键合相色谱法正相键合相色谱法正相键合相色谱法正相键合相色谱法正相键合相色谱法 此法是此法是以极性的有机基团，以极性

53、的有机基团，CN、 NH2。 。双羟基等键合在硅胶表面，作为固 双羟基等键合在硅胶表面，作为固 定相定相；而以非极性或极性小的溶剂（如烃；而以非极性或极性小的溶剂（如烃 类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇、 乙腈等）为流动相，分离极性化合物。乙腈等）为流动相，分离极性化合物。 此时，此时，组分的分配比组分的分配比k值随其极性的值随其极性的 增加而增大，但随流动相极性的增加而增加而增大，但随流动相极性的增加而 降低降低。 这种色谱方法主要用于分离异构体、这种色谱方法主要用于分离异构体、 极性不同的化合物，特别适用于分离不极性不同的化合物，特别适用于分离不

54、同类型的化合物。同类型的化合物。 5. 5. 5.离子性键合相色谱法离子性键合相色谱法离子性键合相色谱法离子性键合相色谱法离子性键合相色谱法离子性键合相色谱法 当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶当以薄壳型或全多孔微粒型硅胶 为基质，化学键合各种离子交换基团，为基质，化学键合各种离子交换基团， 如一如一SO3H 一一CH2NH2、C00H、一一 CH2N（CH3）等时，就形成了离子性等时，就形成了离子性 键合相色谱的固定相；键合相色谱的固定相；流动相一般采用流动相一般采用 缓冲溶液。缓冲溶液。其分离原理与离子交换色谱其分离原理与离子交换色谱 类同。类同。 以上讨论了各种类型化学键合以上讨论了各种类型化

55、学键合 相色谱法，归纳键合相色谱的相色谱法，归纳键合相色谱的最大最大 优点优点是：是：通过改变流动相的组成和通过改变流动相的组成和 种类，可有效地分离各种类型化合种类，可有效地分离各种类型化合 物（非极性、极性和离子型）物（非极性、极性和离子型）。 此外，由于键合到载体上的基团不易此外，由于键合到载体上的基团不易 流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在流失，特别适用于梯度淋洗。据统计，在 高效液相色谱法中，约有高效液相色谱法中，约有8 8O O的分离问题的分离问题 是用键合相色谱法解决。是用键合相色谱法解决。 此法的最大此法的最大缺点缺点是不能用于酸、碱度是不能用于酸、碱度 过大或存在氧化剂的缓

56、冲溶液作流动相的过大或存在氧化剂的缓冲溶液作流动相的 体系。体系。 如何根据样品极性种类来如何根据样品极性种类来选择化学键选择化学键 合的固定相合的固定相，请参看表，请参看表21-321-3。 （三）液一固吸附色谱法（三）液一固吸附色谱法（三）液一固吸附色谱法（三）液一固吸附色谱法（三）液一固吸附色谱法（三）液一固吸附色谱法( ( (LSAC)LSAC)LSAC) 液一固吸附色谱是以固体吸附剂作液一固吸附色谱是以固体吸附剂作 为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体 颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。 液固色谱实质是根据物质在固

57、定相上的液固色谱实质是根据物质在固定相上的 吸附作用不同来进行分离的。吸附作用不同来进行分离的。 1 1分离原理分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，当流动相通过固定相（吸附剂）时， 吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相 分子。同时，当试样分子（分子。同时，当试样分子（X）被流动被流动 相带入柱内，只要它们在固定相有一定相带入柱内，只要它们在固定相有一定 程度的保留就要取代数目相当的已被吸程度的保留就要取代数目相当的已被吸 附的流动相溶剂分用）于是，在固定相附的流动相溶剂分用）于是，在固定相 表面发生竞争吸附表面发生竞争吸附: X + nSad = Xad

58、+ nS 达平衡时达平衡时, ,有有 n ad n ad ad SX SX K 其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在 吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保 留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得 以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。 2. 2. 2.固定相固定相固定相固定相固定相固定相 吸附色谱所用固定相多是一些吸附活吸附色谱所用固定相多是一些吸附活 性强弱不等的吸附剂，如性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、硅胶、氧化铝、 聚酸胶等聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性。由于硅胶的优点较多，如线性 容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多 数试样不发

59、生化学反应等，因此，以硅胶数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶 用得最多。用得最多。 在高效液相色谱法中，表面多孔型在高效液相色谱法中，表面多孔型 和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相， 它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优 点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由 于试样容量较小，目前最广泛使用的还是于试样容量较小，目前最广泛使用的还是 全多孔型微粒填料全多孔型微粒填料。 3 3 3 流动相流动相流动相流动相流动相流动相 一般把吸附色谱中一般把吸附色谱中流动相称作洗脱流动相称作洗脱 剂剂。在

60、吸附色谱中对极性大的试样往往。在吸附色谱中对极性大的试样往往 采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样 宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强 弱可用溶剂强度参数（弱可用溶剂强度参数（0）来衡量，来衡量，0 越大，表示洗脱剂的极性越强。越大，表示洗脱剂的极性越强。 下表列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的下表列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的 0值。在硅胶吸附剂中值。在硅胶吸附剂中0值的顺序相同，数值的顺序相同，数 值可换算（值可换算（0硅胶 硅胶=0.77 0氧化铝）。氧化铝）。 液固色谱最适宜分离那些溶液固色谱最适宜分离那些溶 解在非