聚丙烯酰凝胶电泳分离血清蛋白质.doc

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质Separating Serum Protein by PAGE一 、目的1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理2.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegel electrophoresis, 简称 PAGE） ,是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续体系、 缓冲液离子成分的不连续性、pH 的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成薄的起始区带（厚度 12mm），然后再进行电泳分离。聚丙烯酰凝胶电泳的过程中有三种物理效

2、应：（1）样品的浓缩效应， （2）凝胶的分子筛效应，（3）一般电泳的电荷效应。使样品分离效果好，分辨率高。例如人血清用醋酸纤维素薄膜电泳（ pH8.6 ）可以分成5 7 个成分，而用聚丙烯酰胺凝胶电泳则可分成20 30 条带清晰的成分。下面就聚丙烯酰胺凝胶电泳说明三种物理效应的原理。1、 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4 个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩然后再被分离。（ 1）凝胶层的不连续性：两层不同的凝胶，其作用如下：浓缩胶：为大孔胶，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面积聚成薄层。分离胶：为小孔胶，样品在其中进行电泳和分子筛分离。（ 2）缓冲液离子成分和电位

3、梯度的不连续性：-在浓缩胶中选择 pH6.7，电泳槽缓冲液 pH 为 8.3，HCl 几乎全部释放出 Cl ,甘氨酸（等电点在 6.0；羧基解离 pKa1=2.34, 氨基 NH 3+ 解离 pKa2=9.7 ）在此条件下有极少部分的分-子（ 1 0.1% ）解离成为甘氨酸负离子NH 2CH2COO在 pH6.7 下，大部分蛋白质都以负离子形式存在（大多数蛋白质等电点接近于 pH5.0）。这三种离子都带有相同电荷，当电泳系统通过一定电流后三种离子同时向正极移动，而且它们的有效泳动率按以下次序排列。（有效泳动率 =泳动率 m解离度d）mCl dCl m 蛋 d 蛋 m 甘 d 甘根据有效率泳动率

4、的大小，最快的称为快离子，最慢的称为慢离子，电泳刚开始时，两种凝胶都含有快离子，只有电泳槽中电泳含慢离子，电泳开始后， 由于快离子的泳动率最大，就会很快超过蛋白质， 因此，在快离子的后面形成一离子浓度低的区域即低电导区。 电导与电压梯度是成反比的：E（电压梯度）= （电流强度）/ （电导率）所以低电导区就有了较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速运动。当电压梯度和泳动率乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同，（即 V=mE ）移动速度 =（泳动率 电强强度） 。在快离子和慢离子移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间，形成一稳定而又不断向阳极移动的界面。由

5、于样品蛋白质的有效泳动率恰好介于快离子之间，因此也就聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一个狭小的中间层。（ 3）pH 的不连续性：在浓缩胶与分离胶之间有pH 的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度， 从而控制其有效迁移率。 要求在浓缩胶中， 慢离子较所有分离样品的有效迁移率低，以样品夹在快、 慢离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。2. 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应。 即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相同的蛋白质分之， 也会

6、由于分之筛效应在分离胶中被分开。 此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时， 小分子走在前面， 大分子走在后面。 而在柱层析方法中的分子筛作用， 则是分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。3. 电荷效应 : 蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩， 堆积成层， 形成一狭小的高浓度的蛋白区， 但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同， 因而迁移率不同。 承载有效电荷多的，泳动的快， 反之则慢。 因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的条带。 在进入分离胶中时，此电荷效应仍起作用。三、实验用品（一）材料兔血清（二）器材1.小烧杯50ml2 个2.微量注射器一支3.电

7、泳仪电泳槽胶框各一套4.玻璃板 2 块5.梳子1 个6.吸耳球 1 个7.染色缸纱布块8.乳头滴管滤纸条滤纸块（三）试剂1.丙烯酰胺储存液单丙烯酰胺22.2 克，双丙烯酰胺0.6 克，加水至100ml混合后滤纸过滤在棕色瓶中保存。2.分离胶缓冲液取1N HCl48ml，Tris（三羟甲基氨基甲烷）36.3 克，加水至100ml调pH至8.93.浓缩胶缓冲液取1NHCl48ml ， Tris 5.98克，加水至100ml ，调pH至6.74.0.025%溴酚兰5.5%TEMED6 .1.5%过硫酸胺7. 1.5% 琼脂糖溶液8. 20% 蔗糖溶液9 .电极缓冲液取 Tris 6 克，甘氨酸 28

8、.8 克，加水至 1000ml 。调 pH 至 8.310. 染色液0.25g 考马斯亮兰， 454ml 50% 甲醇水溶液，46ml 冰醋酸。11.脱色液225ml 冰醋酸， 150ml 甲醇， 2625ml蒸馏水。四、实验步骤1 .凝胶板装置（ 1）将两块玻璃板装入胶膜的相应模框中。（ 2）用 1.5%的琼脂糖将模框下端封好，使无缝隙以防漏胶。（ 3）待琼脂糖冷却后，将模框固定于电泳槽，注意点样端对着负极。2 .分离胶的配置丙烯酰胺储存液8.4ml分离胶缓冲液（ pH8.9 ）12.5ml5%TEMED1.5ml蒸馏水0.75ml在小烧杯中混匀后，加入1.5%过硫酸胺溶液0.3ml，混匀后

9、，立即轻轻沿着凹型上缘到入两层玻璃间约2/3 高度。用滴管在凝胶上层轻轻住入一层蒸馏水，在室温下聚合大约需 20-40 分钟。凝胶形成后，在水层与凝胶层间便可见一层清晰的界面，然后用滤纸条将水层吸尽，此时分离胶已制成。3 .浓缩胶配制丙烯酰胺储存液1.13ml浓缩胶缓冲液（ pH6.7 ）3.75ml5%TEMED1.0ml蒸馏水1.75ml在小烧杯中混匀后，加入1.5%过硫酸胺溶液0.5ml，混匀后，到入分离胶上层，轻轻插入梳子。注意梳子与胶面不要留有气泡。聚合后取出梳子。4.血清样品的配制用一个小烧杯，取血清0.3ml ， 0.025% 溴酚蓝1 滴，轻轻混匀后加入20%蔗糖溶液0.65ml ，混匀后备用。5.注入电泳缓冲液将电极缓冲液分别注入电泳槽正负极两侧。6.点样小心将微量注射器插入样品格，轻轻推入样品 20 40l，防止注射器内气泡进入，点样后注射器用蒸馏水充分洗净。7.电泳电泳以每厘米2mA 开始，待样品进入分离胶时加大电流至3 5mA/cm 。当溴酚蓝指示剂到达凝胶板前缘时即停止电泳。8.