不同复性方法制备的rhBMP(一).doc

1、不同复性方法制备的rhBMP(一)作者：赵玮钦，陈苏民，王涛，张晓楠，王丽【关键词】重组人骨形成蛋白2 成熟肽； ,高密度发酵； ,蛋白质纯化； ,蛋白质复性ComparisonofdifferentrefoldingmethodsininducingectopicboneformationbyrhBMP2m【Abstract】AIM:Torefoldrecombinanthumanbonemorphogeneticprotein2maturepeptide(rhBMP2m)bydifferentmethods,andcomparetheactivityofinducingtheformati

2、onofectopicbone.METHODS:Theengineeredstrain,whichcouldexpressrhBMP2matahighlevel,wasfermentedinhighdensity,andinducedbytemperature.Thebacterialcellswerecollectedandlyzed.Thegainedinclusionbodieswerepurifiedbyionexchangechromatography.ThepurifiedrhBMP2mwasrefoldedbythreedifferentmethods: rhBMP2mwasdi

3、alyzedwithpH4.8bufferforrefolding. rhBMP2mwasrefoldedbymeansofdilutionmethodinpH9.0buffer. rhBMP2mwasdialysedinpH6.5buffertorefold.It(1mg)wasplantedintomousemusclestoobservetheformationofbonewithoutanycarrier.RESULTS:ThepurityoftheacquiredrhBMP2mwas98%afterionexchangechromatography.TheresultingrhBMP

4、2mwassolubleafterrefoldingwithpH4.8bufferandhadnoanylossafterpassingthroughsterilizingfiltermembrane.When1mgofthelyophilizedrhBMP2mwasplantedintomousemuscles,itinducedectopiccartilageafter2weeksandtrabecularboneafter4weeks. rhBMP2mwassolubleafterrefoldingwithpH9.0buffer.TherefoldedrhBMP2mseemeddisso

5、lvablebymacroscopicobservation,butlostover90%afterfiltratingsterilization.After1mgofthislyophilizedrhBMP2mwasplantedintomuscles,cartilageappearedafter1week,boneformedafter2weeks,andtrabecularbonewasseenafter3weeks. Afterdialysis,rhBMP2mwasprecipitated.When1mgofinsolublerhBMP2mwasplantedintomuscles,i

6、tinducedtrabecularbonein2weeksandmyeloidcellsafter4weeks.CONCLUSION:Comparedwithacidandalkalinecondition,rhBMP2mrefoldedinneutralconditionhasthebestactivityofinducingtheformationofbone,butrhBMP2mrefoldedinacidconditionhasbetterdissolubility.【Keywords】humanbonemorphogeneticprotein2maturepeptide;highd

7、ensityfermentation;proteinpurification;proteinrefolding【摘要】目的：用三种不同方法复性重组人骨形成蛋白2 成熟肽(rhBMP2m)，比较其异位诱骨活性 .方法：将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达，裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化.纯化后的rhBMP2m 用三种不同方法复性： 对 pH4.8 复性液透析复性； 对 pH9.0 复性液稀释复性； 对 pH6.5 复性液透析复性 .不加任何载体， 1mg 复性后 rhBMP2m 直接植入小鼠肌肉观察诱骨生成 .结果：得到纯度为 98的 rhBMP2m.pH4.8 透析复性后蛋白可溶 .

8、经过滤除菌，可溶性 rhBMP2m 没有损失 .冻干后植入肌袋， 2wk 后诱导生成软骨， 4wk诱导生成骨小梁 . pH9.0 稀释复性后虽然肉眼观察蛋白似为可溶，但经除菌膜过滤 rhBMP2m 损失 90%以上 .冻干后植入肌袋， 1wk 诱导生成软骨， 2wk 诱导软骨内成骨， 3wk 出现骨小梁 . pH6.5 透析复性后蛋白不可溶，植入肌袋， 2wk 诱导生成骨小梁， 4wk 后出现骨髓样细胞 .结论：相比酸性和碱性条件，中性条件下复性的rhBMP2m 的诱骨活性最好，但酸性条件下复性的rhBMP2m 溶解度好 .【关键词】重组人骨形成蛋白2 成熟肽；高密度发酵；蛋白质纯化；蛋白质复

9、性0 引言重组人骨形成蛋白2成熟肽(recombinanthumanbonemorphogeneticprotein2maturepeptide,rhBMP2m)，属于转化生长因子（transforminggrowth factor ,TGF）超家族，它在骨骼再生与修复过程，以及胚胎发育的不同阶段发挥着重要的作用1.目前，rhBMP2m 已经被商业化生产并应用在多种临床研究中，包括治疗骨质缺损、颌面修复等.利用哺乳动物细胞制备rhBMP2m，其表达水平很低 ,纯化过程复杂，使得产品价格高昂，制约着其推广应用.利用大肠杆菌表达rhBMP2m，获得包含体，体外复性后可以得到具有生物活性的rhBMP

10、2m2.但是其复性过程复杂，总收得率低，复性缓冲液所要试剂昂贵 .本研究采用三种不同的复性方法，通过动物试验比较不同方法复性的rhBMP2m 的诱骨活性，为获得一种简单而且廉价的方法以改进活性rhBMP2m 的生产 .1 材料和方法1.1 材料雄性健康昆明小鼠12 只，体质量 1822g，由第四军医大学实验动物中心 提 供 ； 溶 菌 酶 ， DNase 购 自 美 国Invitrogen公 司 ； 菌 种DH5 /pDH2rhBMP2m，BCA 蛋白定量试剂为第四军医大学生物化学与分子生物学教研室配制并保存； 低分子量蛋白 marker 购自上海生化所；15L 全自动发酵罐购自美国 NBS

11、公司； SPSepharoseFF，QSepharoseFF购自瑞典 Pharmacia公司；低分子蛋白透析膜（截留分子量 10000）购自北京华美公司； 超声粉碎器购自美国 ColeParmerInstrument 公司；低温高速离心机购自湖南湘西仪器仪表厂；MinitanTM 超滤系统购自美国MILIPORE公司；SDSPAGE垂直平板电泳系统购自美国BIORED公司；冻干机购自丹麦 HETO公司； 0.22 m微孔滤膜来自上海兴亚净化材料厂.1.2 方法1.2.1DH5 /pDH2rhBMP2m高密度发酵、裂菌、包涵体洗涤取 -70保存的 DH5/pDH2rhBMP2m 工程菌株甘油菌种

12、，划 LB琼脂平板，含 100mg/L 氨苄青霉素， 32培养20h.挑单菌落入 6mLLB，30摇床培养 16h.转入 300mLLB，30摇床培养 10h.转入 15L发酵罐 30培养 ,计算机自动控制搅拌、通气溶氧，30培养 16h.发酵罐内 42诱导表达 4h，结束发酵 .裂解缓冲液 (100g/L 蔗糖，10mmol/LpH8.0TrisHCL，1mmol/LEDTA)悬浮菌体，加溶菌酶，冰浴中 超 声 裂 菌 ， 离 心 后 收 得 包 涵 体 . 洗 涤 液 (5g/LTritonX100 ，10mmol/LpH8.0TrisHCl， 1mmol/LEDTA)悬浮包涵体 ,超声处

13、理 ,离心收集包涵体 ,反复 4 次.1.2.2 包涵体纯化 SPSepharoseFF阳离子柱层析分离：洗涤后的包涵体溶解于SPbuffer（8mmol/L 尿素， 20mmol/LpH6.5 磷酸钠缓冲液， 0.014mol/L 巯基乙醇）中，上 SPSepharoseFF阳离子柱，用不同浓度 NaCl 溶液洗脱，透析除去尿素，离心收集沉淀 . QSepharoseFF 阴离子柱层析纯化：将SPSepharoseFF柱层析纯化的蛋白质沉淀溶解于Qbuffer（8mol/L 尿素，20mmol/LpH9.0Tris，0.014mol/L 巯基乙醇）中，上 QSepharoseFF阳离子柱，用

14、不同浓度NaCl 溶液洗脱，收集各蛋白峰，透析除去尿素和巯基乙醇，离心收集沉淀.1.2.3 蛋白复性 pH4.8 透析复性 rhBMP2m：纯化后的 rhBMP2m 经变性液（ 8mmol/L尿素， 20mmol/LpH6.5 磷酸钠缓冲液， 0.014mol/L 巯基乙醇）溶解 ,装 入透析 袋 内 , 对pH4.8 的 复 性 液透析 （ 10mmol/LpH4.8NaAc，50mmol/LNaCl），换液多次以彻底去除尿素和巯基乙醇 .透析复性结束后收集复性蛋白液， 复性的蛋白液可通过 0.22 m微孔滤膜除菌， 或进一步浓缩和冰冻干燥 . pH6.5 透析复性 rhBMP2m：纯化后的 rhBMP2m 经变性液（8mmol/L 尿素，20mmol/LpH6.5 磷酸钠缓冲液， 0.014mol/L 巯基乙醇）溶解 ,装入透析袋内，对 pH6.5 的复性液透析复性 24h，换液 2 次以彻底去除尿素和巯基乙醇 .透析复性结束后收集离心复性后沉淀的蛋白质 . pH9.0 稀释复性 rhBMP2m：纯化后的 r