分生补充正负筛选法

1、正负筛选法（positive and negtive selection） 正负筛选法的基本方法是：构建一种特殊的载体，该载体含有一段与靶基因同源的序列，在这段序列的某一外显子中插入Ncor基因作为正选择标记；在同循序列之外的3末端，或3，5两个末端接上单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）基因的序列作为负筛选标记。经酶切后使其线性化，然后用电脉冲转染法导入细胞中，继续体外培养，并以药物G -418和GANC作双重筛选。如果所导入的重组 DNA与受体细胞基因组DNA之间发生非同源重组，则外源基因通常是从头至尾均整合入受体细胞基因组中，故其基因组中含有外源的基因（Neor， HSV-tk），

2、此时的Neor和HSV-tk基因同时表达，其中Neor的基因产物使细胞具有G-418抗性，而HSV-tk基因的产物则将GANC磷酸化产生对细胞有毒性的物质，使细胞死亡。若为同源重组，外源目的基因及Neor基因会整合到受体细胞基因组同源序列的座位上，而位于同源序列外端的 HSV-tk基因则在重组后丢失，因而此时仅有 Neor表达，受体细胞同时具有G-418及GANC双重抗性而在选择培养基中存活下来。Mansour和 Capecchi采用此方法，已完成ES细胞 Hprt，int- 2，hox1.2，hox1.3等基因的定点突变。 基因敲除：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的方法。常用同源重

3、组的方法敲除目的基因，观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。条件性基因敲除条件性基因打靶(conditional gene targeting)，可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因打靶方法。以Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结合的基因打靶技术。它实际上是在常规的基因打靶的基础上，利用Cre重组酶介导的位点特异性重组技术，在对小鼠基因修饰的时空范围上设置一个可调控的“按钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。条件性基因打靶特点 过条件性基因敲除，研究完全敲除具有致死效应的基因的功能以及基因在特定的组织细胞

4、或个体发育特定阶段的功能。 通过条件性基因激活，实现转基因的可控制性表达。 通过Cre切除条件性基因修复(Cre excision-conditional gene repair)，进行基因的可修复性敲除，以研究一个基因的多种功能。诱导性基因打靶它主要由Cre-LoxP及诱导系统组成。Cre-loxP系统由重组酶Cre和该酶的特定作用位点LoxP组成，其中的重组酶Cre可诱导LoxP所在的DNA发生缺失、插入、重复、倒位和易位等多种形式的基因突变或染色体畸变。诱导性基因打靶就是以该系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制、或

5、利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在LoxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。根据所用诱导剂的种类，诱导性基因打靶可分为四环素诱导型、干扰素诱导型（二者所用诱导剂为控制Cre基因表达的启动子活性的活化物)和激素诱导型(所用诱导剂为Cre酶活性的激活物)等几种类型。而对由病毒或配体/DNA等载体介导的Cre定位表达系统来说，如果其Cre基因的表达或其目的产物Cre酶活性并不需要诱导剂的存在，那么严格说来它并不属于诱导性基因打靶的范畴。反之，则不失为一种不错的诱导性基因打靶策略，并

6、且它因为不用建立Cre的表达或Cre的酶活性具有可诱导特性的转基因动物而可使成本降低。总之，以Cre-LoxP系统介导的位点特异性重组为基础的诱导性基因打靶术的确有其优势： 诱导基因突变的时间可人为控制； 可避免因基因突变而致死胎的问题； 在2个LoxP位点之间的重组率较高； 如用病毒或配体/DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。 如果在Cre-ERT和Ad-Cre表达系统中采用组织细胞特异的启动子来控制Cre的表达，其诱导的基因重组的组织细胞特异性还可进一步提高。基因诊断基因诊断又称DNA诊断或分子诊断，通过分子生物学和分子遗传学的技术，直接

7、检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。原理：核酸分子杂交是基因诊断的最基本的方法之一。 基因诊断技术它的基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补的原则进行，它不仅能在DNA和DNA之间进行，也能在DNA和RNA之间进行。因此，当用一段已知基因的核酸序列作出探针，与变性后的单链基因组DNA接触时，如果两者的碱基完全配对，它们即互补地结合成双链，从而表明被测基因组DNA中含有已知的基因序列。由此可见，进行基因检测有两个必要条件，一是必需的特异的DNA探针；二是必需的基因组DNA。当两者都变性呈单链状态时，就能进

8、行分子杂交。 一、基因探针基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。常用技术综述当细胞的基因组DNA用特定的内切酶如Eco R切割时， 基因诊断凡有GAATTC的地方都被切开，得到许多长度一定但互不相等的片段，需要分析、分离的基因或DNA片段就在其中某一特定的的片段上。 然而许多长短不同的DNA片段混合在一起是很难分析的。因此首先必需将它们按大小（长短）分离开来，这可借助凝胶电泳来完成。在电泳时，分子量愈小的片段的迁移愈快，愈大的片段愈慢。因此，在电泳结束时可以获得一个由

9、大到小连续的带谱（smear），而由许多细胞基因组得来的某一特定片段，因其长度相同将处于同一位置，有利于检出。但凝胶易碎且操作不便。英国科学家Southern首创印迹法克服了上述困难。Southern印迹法Southernblot的基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。 当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素标记了的探针进行杂交

10、，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有珠蛋白基因DNA才能结合上珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。 分子杂交是基因探测的基础，除了用印迹杂交外，还有斑点杂交法。即将DNA样品变性后直接点在硝酸纤维滤膜上，再与探针杂交，或者将细胞或病毒点在膜上，菌落或菌斑原位地吸

11、附在膜上，经过变性处理，再进行杂交。斑点杂交多用于病原体基因，如微生物的基因，但也可用于检查人类基因组中的DNA序列。聚合酶链反应近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的23小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。 首先应按照欲检测的DNA的5和3端的碱基顺

12、序各合成一段长约1720余个碱基的寡核苷酸作为引物（primer），其次是将待检测的DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热聚合酶。在较低的温度，引物将与待扩增的DNA链复性结合，然后的聚合酶的作用下，利用溶液中的核苷酸原料，不断延伸合成新互补链，这样，一条DNA双链就变成了两条双链。若继续按照变性（9295）复性（4060）引物延伸（6572）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增2n，即100余万倍。PCR反应特异性强，灵敏度高，极微量的DNA即可作为扩增的模板得到大量的扩增片段。毛发、血痕，甚至单个细胞的DNA即可供PCR扩

13、增之用。因此它用于病原体DNA的检查、肿瘤残留细胞的检出、罪犯或个体遗传物质的鉴定以及遗传病的基因诊断等。 已可对一系列的遗传病进行PCR诊断。如果疾病是由基因缺失引起的（如地贫），则在缺失两端设计一对引物进行扩增，就不会得到扩增产物或只能得到缩短了的扩增产物。如果疾病是由点突变引起的，而突变的位置和性质已知，则在设计引物时使之包括突变部位，由于突变后的碱基不配对，结果无扩增片段；或者在引物设计时于其3端设计一个错误的核苷酸，使之与突变了的核苷酸配对，其结果是正常引物不能扩增，而用错误的引物能扩增，从而可对突变的存在作出判断。 PCR技术目前有许多新的发展，用途日益扩大。例如，可用RNA为模板

14、经过逆转录再行扩增的RTPCR；改变两引物浓度，使其相差100倍，结果得到大量单链产物，称为不对称PCR，其单链产物可用于序列分析；在一个反应中加入多对引物同时检测多个部位的多重PCR等等。扩增片段长度多态性小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析。等位基因的特异寡核苷酸探针诊

15、断法当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，一种与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来。 PCR可结合ASO，即PCRASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间

16、，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。单链构象多态性诊断法单链构象多态性（signlestrand conformation polymorphism，SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。 PCRSSCP法具有能快速、灵敏地检测有无点突变或多态性的优

17、点，但如欲阐明突变的碱基性质，则需作序列分析。原核生物基因组和真核生物基因组的区别：1、真核生物基因组指一个物种的单倍体染色体组(1n)所含有的一整套基因。还包括叶绿体、线粒体的基因组。 原核生物一般只有一个环状的DNA分子，其上所含有的基因为一个基因组。2、原核生物的染色体分子量较小，基因组含有大量单一顺序（unique-sequences），DNA仅有少量的重复顺序和基因。真核生物基因组存在大量的非编码序列。包括：.内含子和外显子、.基因家族和假基因、重复DNA序列。真核生物的基因组的重复顺序不但大量，而且存在复杂谱系。3、原核生物的细胞中除了主染色体以外，还含有各种质粒和转座因子。质粒常

18、为双链环状DNA，可独立复制，有的既可以游离于细胞质中，也可以整合到染色体上。转座因子一般都是整合在基因组中。真核生物除了核染色体以外，还存在细胞器DNA，如线粒体和叶绿体的DNA，为双链环状，可自主复制。有的真核细胞中也存在质粒，如酵母和植物。4、原核生物的DNA位于细胞的中央，称为类核（nucleoid）。真核生物有细胞核，DNA序列压缩为染色体存在于细胞核中。5、真核基因组都是由DNA序列组成，原核基因组还有可能由RNA组成，如RNA病毒。DNA是遗传信息的载体，故亲代DNA必须以自身分子为模板准确的复制成两个拷贝，并分配到两个子细胞中去，完成其遗传信息载体的使命。而DNA的双链结构对于

19、维持这类遗传物质的稳定性和复制的准确性都是极为重要的。（一）DNA的半保留复制Waston和Click在提出DNA双螺旋结构模型时曾就DNA复制过程进行过研究，他们推测，DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋分开，每条链分别作模板合成新链，每个子代DNA的一条链来自亲代，另一条则是新合成的，故称之为半保留式复制(semiconservative replication)。1958年Meselson和Stahl进行了如图8-3-5的实验证明了DNA分子是以半保留方式进行自我复制的。图8-3-5 Meselson和Stahl证明DNA半保留复制的实验（二）DNA复制的起始，方向和速度

20、DNA在复制时，双链DNA解旋成两股分别进行。其复制过程的复制起点呈现叉子的形式，故称复制叉。以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为35走向，在其上DNA能以53方向连续合成，称为前导链(leading strand)；另一条模板链为53走向，在其上DNA也是53方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的DNA链，该链称为后随链(lagging strand)。实验证明DNA的复制是由一个固定的起始点开始的。一般把生物体的单个复制单位称为复制子。一个复制子只含一个复制起点。一般说，细菌，病毒即线粒体DNA分子均作为单个复制子完成

21、其复制，真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制，即它们的基因组包括多个复制子。多方面的实验结果表明，大多数生物内DNA的复制都是从固定的起始点以双向等速方式进行的。复制叉以DNA分子上某一特定顺序为起始点，向两个方向等速生长前进。图8-3-6 DNA复制过程DNA复制过程（三）DNA复制过程 以原核生物DNA复制过程予以简要说明1DNA双螺旋的解旋 DNA在复制时，其双链首先解开，形成复制叉，而复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程（1）单链DNA结合蛋白（singlestranded DNA binding protein, ssbDNA蛋白） ssbDNA蛋白是

22、较牢固的结合在单链DNA上的蛋白质。原核生物ssbDNA蛋白与DNA结合时表现出协同效应：若第1个ssbDNA蛋白结合到DNA上去能力为1，第2个的结合能力可高达103；真核生物细胞中的ssbDNA蛋白与单链DNA结合时则不表现上述效应。ssbDNA蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制后才脱下来，重新循环。所以，ssbDNA蛋白只保持单链的存在，不起解旋作用。（2）DNA解链酶（DNA helicase） DNA解链酶能通过水解ATP获得能量以解开双链DNA。这种解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。如果双链DNA中有单

23、链末端或切口，则DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。复制时，大部分DNA解旋酶可沿滞后模板的53方向并随着复制叉的前进而移动，只有个别解旋酶（Rep蛋白）是沿着35方向移动的。故推测Rep蛋白和特定DNA解链酶是分别在DNA的两条母链上协同作用以解开双链DNA。（3）DNA解链过程 DNA在复制前不仅是双螺旋而且处于超螺旋状态，而超螺旋状态的存在是解链前的必须结构状态，参与解链的除解链酶外还有一些特定蛋白质，如大肠杆菌中的Dna蛋白等。一旦DNA局部双链解开，就必须有ssbDNA蛋白以稳定解开的单链，保证此局部不会恢复成双链。两条单链DNA复制的引发过程有所差异，但是不

24、论是前导链还是后随链，都需要一段RNA引物用于开始子链DNA的合成。因此前导链与后随链的差别在于前者从复制起始点开始按53持续的合成下去，不形成冈崎片段，后者则随着复制叉的出现，不断合成长约23kb的冈崎片段。2冈崎片段与半不连续复制 因DNA的两条链是反向平行的，故在复制叉附近解开的DNA链，一条是53方向，另一条是35方向，两个模板极性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是53方向，不是35方向，因而无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题。为解释DNA两条链各自模板合成子链等速复制现象，日本学者冈崎（Okazaki）等人提出了DNA的半连续复制（semidiscontinuous rep

25、lication）模型。1968年冈崎用3H脱氧胸苷短时间标记大肠杆菌，提取DNA，变性后用超离心方法得到了许多3H标记的，被后人称作冈崎片段的DNA。延长标记时间后，冈崎片段可转变为成熟DNA链，因此这些片段必然是复制过程中的中间产物。另一个实验也证明DNA复制过程中首先合成较小的片段，即用DNA连接酶温度敏感突变株进行试验，在连接酶不起作用的温度下，便有大量小DNA片段积累，表明DNA复制过程中至少有一条链首先合成较短的片段，然后再由连接酶链成大分子DNA。一般说，原核生物的冈崎片段比真核生物的长。深入研究还证明，前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物界具有普遍性，故称为DNA双螺旋的

26、半不连续复制。3复制的引发和终止 所有的DNA的复制都是从一个固定的起始点开始的，而DNA聚合酶只能延长已存在的DNA链，不能从头合成DNA链，新DNA的复制是如何形成的？经大量实验研究证明，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶从RNA引物3端开始合成新的DNA链。对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点，一直合成下去。对于后随链，引发过程较为复杂，需要多种蛋白质和酶参与。后随链的引发过程由引发体来完成。引发体由6种蛋白质构成，预引体或引体前体把这6种蛋白质结合在一起并和引发酶或引物过程酶进一步组装形成引发体。引发体似火车头一样在后随链分叉的方向前进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶 III 作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 将缺口补齐，再由DNA连接酶将每两个冈崎片段连在一起形