血细胞染色方法的探讨

1、长沙医学院毕业设计(论文)课 题 名 称 血细胞染色方法的探讨 学 生 姓 名 学 号 院(系)、年级专业 指 导 教 师 职 称 2017年 04 月 30 日 摘要目的：本论文用不同的染色方法对血涂片染色，观察血细胞的形态，比较对血细胞的不同辨别结果。方法：通过Giemsa染色法、Wright染色法和 Giemsa-Wright混合液染色3种染色方法对血涂片进行染色和血细胞的形态学观察。结果：在染色时间上Giemsa 染液染色时间最长、Wright 染液染色时间最短、Giemsa-Wright 混合液染色时间介于两者之间，Giemsa 染液的细胞核染色效果好，细胞质界限清晰，但细胞质中的颗

2、粒染色效果较差；Wright 染液染对细胞核和细胞质中的颗粒染色效果较好，细胞质的界限不淸；Giemsa-Wright 混合染色具细胞核和细胞质中的颗粒染色效果较好，细胞界限清晰。结论：Giemsa染色法、Wright染色法和 Giemsa-Wright 混合染色三种染色方法均能有效的协助甄别血细胞，Giemsa-Wright 混合染色方法相较于前两种方法染色效果更为明显，值得广泛应用。关键词：血细胞；血涂片；Giemsa染色法；Wright染色法；Giemsa-Wright 混合染色法；细胞形态学I ABSTRACTObjective: In this paper, different st

3、aining methods were used to stain the blood smears, observe the morphology of blood cells, and compare the different results of blood cells. Methods: The blood smears were stained by Giemsa staining, Wright staining and Giemsa-Wright staining. The morphological changes were observed. Results:The Gie

4、msa-Wright mixture had the shortest staining time, the Giemsa-Wright mixture had the shortest dyeing time, the Giemsa-Wright mixture had the same staining time, and the cytoplasmic boundaries were clear, but the cytoplasm was clear The staining effect of Wright dye on the nucleus and cytoplasm was b

5、etter, and the cytoplasmic boundaries were not clear. Giemsa-Wright mixed staining had better staining effect on the nuclei and cytoplasm, and the cell boundaries were clear . Conclusion: Giemsa staining method, Wright staining method and Giemsa-Wright hybrid staining method can effectively help to

6、identify blood cells. Giemsa-Wright mixed staining method is more obvious than the first two methods, and it is worthy to be widely used.Key Words: blood cells; blood smear; Giemsa staining; Wright staining; Giemsa-Wright mixed staining; cell morphology目录摘要IABSTRACTII第一章 绪论1第二章 材料与方法22.1 实验材料22.1.1

7、主要仪器22.1.2 试剂及药品22.1.3主要试剂的配制22.2 实验方法42.2.1 血涂片的制作42.2.2 Giemsa 染色42.2.3 Wright 染色42.2.4 Giemsa-Wright 染色42.2.5 注意事项5第三章 结 果53.1 Giemsa 染色53.2 Wright 染色63.3 Giemsa-Wright 染色6第四章 探究不同条件下三种染色方法的效果64.1 不同染色条件下Giemsa的染色效果64.2 不同条件下 Wright染液的染色效果74.3 不同条件下Giemsa-Wright混合染液染色效果7第五章 讨 论74.1 Giemsa 氏染色法74.

8、2 Wright 氏染色法84.3 Wright-Giemsa 混合法8附 图 表11参考文献14REFERENCES15致谢18第一章 绪论血细胞存在于血液中,随着血液的流动遍及全身。以哺乳动物来说，扮演了主要的免疫的角色的是血细胞中的白细胞【1】。白细胞能在病菌侵入人体时，穿过毛细血管壁，聚集到病菌入侵部位，将病菌包围并吞噬。要从根本上解决疾病的危害，必须对不同种类生物的免疫机制进行深入研究，因此对血细胞的研究在生物免疫反应科研进程中起着至关重要的作用，但目前对很多类生物的血细胞的分类及其功能研究仍然不是很充分，不同研究者之间尚未达成共识，这对地球上生物免疫学的研究造成了很大的障碍【2-4

9、】。近百年来国内外的学者应用光镜、电镜、组织化学、免疫学单克隆抗体、物理染色等技术对血细胞形态、结构进行观察分类，观察细胞内各种组分的分子组成及功能。尤其是血细胞染色法简便易于操作，对于动物的生理和病理研究具有十分重要的意义,特别是对于与血液及细胞免疫相关的疾病的鉴定意义重大，血细胞染色观察至今仍是最基本的诊断手段。 血细胞涂片染色效果的好坏,对于细胞的形态观察和分类具有决定性的意义【5-7】。通过研究血细胞染色方法，来进一步分析血细胞对免疫反应的作用，对于解决人类和其他生物的疾病具有重大的意义。 本文就三种血细胞染色方法进行探讨，观察三种方法下血细胞的不同染色效果以及各自对细胞分类影响。 第

10、二章 材料与方法2.1实验材料2.1.1 主要仪器培养皿 保温箱分析检测的仪器灭菌箱台式离心机 血细胞计数板显微镜2.1.2 试剂及药品姬姆氏色素(BS) 钟楼区北港海拓实验仪器经营部瑞氏色素(BS)上海展云化工有限公司磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、甲醛 连云港市德邦精细化工有限公司乙醇、二甲苯、盐酸、氢氧化钠连云港市德邦精细化工有限公司 2.1.3主要试剂的配制（1） Giemsa染液的配制 取姬姆氏色素(BS) 0.5g放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56温箱中2小时后，加入甲醇33ml，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于04保存)【8-11】。（2）

11、Wright 染液的配制 将瑞氏色素(BS) 0.1g放入清洁干燥研钵中，先加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒入棕色试剂瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，60ml的甲醇全部用完为止。染液配好后放于室温下，一周后即可使用。新配制染液效果较差，放置时间延长，染色效果越好。久置应密封，以免甲醇挥发或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油23ml，除可防止甲醇过早挥发外，也可使细胞着色清晰。（3） Giemsa-Wright染液的配制 取 姬姆氏色素(BS)、瑞氏色素(BS)各1g，放入研钵，慢慢把10ml甘油倒入研钵内，仔细研磨至完全溶解，然后加入500ml甲醛，将配制好的染

12、液密封保存棕色瓶内。（4） Sorensen缓冲液的配制 称取磷酸二氢钾（无水）1 g，磷酸氢二钠（无水）1 g；加蒸馏水至1000 ml使其溶解。配好后磷酸盐缓冲溶液应校正PH值，其范围在PH6.47.0即可，后塞紧瓶口备用。2.2 实验方法2.2.1 血涂片的制作 用蘸有体积分数为75%的酒精的脱脂棉,对将要取血的部位（如指尖）进行消毒；用已消毒的针尖刺破指尖的皮肤；挤出一滴血,滴在已消毒的载玻片上；另取一片载玻片作推片,将推片自血滴左侧向右移动；当血滴均匀地附着在两片之间后,再将推片向左平稳地推移（两片成3045度夹角）；推出均匀的血膜【12】。2.2.2 Giemsa 染色 染色方法:

13、 待血涂片干燥后，将涂片放入湿盒，加 4 6 滴 Giemsa 染色液覆盖血膜，染色 35 分钟，然后加 8 12 滴Sorensen缓冲液染色 25 分钟，自来水冲洗，晾干，封藏。2.2.3 Wright 染色 染色方法: 将血涂片放入湿盒，加入数滴 Wright 染色液，使染液将涂片完全覆盖，染色2 分钟，然后加等量的Sorensen缓冲液 ，静止 3 分钟，自来水冲洗，晾干，封藏。2.2.4 Giemsa-Wright 染色 染色方法: 待血膜干燥后，滴加 Giemsa-Wright染色液 4 5 滴，染色 3 分钟，然后加Sorensen缓冲液 2 3 倍，混匀，染色 15分钟，自来水

14、冲洗，晾干，封藏。2.2.5 注意事项（1）PH对细胞染色有影响。由于细胞中各种蛋白均为两性电解质，所带电荷随溶液PH而定。对某一蛋白质而言，如环境PHPI（蛋白质的等电点），则该蛋白质带正电荷，即在酸性环境中正电荷增多，易与酸性伊红结合，染色偏红；相反，则易与美蓝天青结合，染色偏蓝。为此，应使用清洁中性的玻璃片，稀释液必须用PH：6.46.8的确良缓冲液。冲洗玻片必须用流水【13】。（2） 未干透的血膜不能染色，否则染色时血膜易脱落。（3） 染色时间与染液浓度、染色温度成反比；而与细胞数量成正比。（4）冲洗时不能先倒掉染液，应用流水冲去，以防染料沉淀在血膜上。（5） 如血膜上有染料颗粒沉积，

15、可加少许甲醇溶解，但需立即用水冲洗掉甲醇，以免脱色。（6）染色过淡，可以复染。复染时应先加缓冲液，创造良好的染色环境，而后加染液，或加染液与缓冲液的混合液，不可先加染液。（7） 染色过深可用水冲洗或浸泡水中一定时间，也可用甲醇脱色。（8）染色偏酸或偏碱时，均应更换缓冲液再重染。 第三章 结 果3.1 Giemsa 染色 显微镜下观察血涂片，红细胞呈粉红色，在厚薄均匀处，略有碟状感。白细胞浆中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩。细胞核染紫红色或蓝紫色，核染色质结构清楚。粒细胞的细胞核和细胞本身的界限分明 ( 图版 : 图G1 图G4 ) ，但细胞质中的颗粒染色较差，分辨的不是十分清晰【13-1

16、6】。3.2 Wright 染色 显微镜下观察血涂片，血膜外观染成淡紫红色。显微镜下，红细胞呈粉红色，在厚薄均匀处，略有碟状感。白细胞浆中颗粒清楚，并显示出各种细胞特有的色彩。细胞核染紫红色，核染色质结构清楚。该 结 果 与Giemsa 滴染相似，粒细胞细胞质中的颗粒着色较好，但细胞核不如 Giemsa 滴染时清晰( 图版 : 图W1 图W4) ，细胞质界限不是十分清晰，有时看不到细胞质界限【17】。3.3 Giemsa-Wright 染色 显微镜下观察血涂片，红细胞呈桔红色 ；中性粒细胞核蓝色 ，颗粒呈紫色 ；嗜酸性粒细胞核呈蓝色 ，颗粒呈红色或桔红色；嗜碱性粒细胞核呈暗蓝紫色,，颗粒呈深蓝

17、黑色；淋巴细胞核深蓝紫色,，胞质天蓝色；单核细胞核蓝紫色，胞质灰蓝色。其中以嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞颗粒最清晰。Giemsa-Wright 滴染时，染色时间介于 Giemsa 和 Wright 染色之间，其结果是粒细胞 的细胞核和细胞质分均着色较好，细胞质中的颗粒成分和细胞界限均清洗可见 ( 图版：图G-W1图G-W4)。第4章 探究不同条件下三种染色方法的效果4.1不同染色条件下Giemsa的染色效果 采用Giemsa染液,在不同染液用量、染色时间、分色方式和分色时间等条件下,对血涂片进行染色。显微镜下观察血细胞的染色效果，部分结果见表1。在实验进程中我们还对比了不同温度条件下姬姆萨染液的

18、结果,发现38条件下的染色效果比25条件下的效果好。38温度条件下尤以下四种情况染色效果为佳,可以对血细胞的种类进行明确区分:染色20min,分色1min；染色10min，水洗分色；珍适量染料染2030min；染色2030min，50%乙醇分色5s。4.2不同条件下 Wright染液的染色效果 采用 Wright染液:缓冲液=1:2的比例，改变染色时间、分色方式和分色时间等染色条件,对血涂片进行染色,显微镜下观察染色效果,部分结果见表2。由表2可知,瑞氏染液在25染色15min后,用95%或者50%的乙醇分色5s的染色条件下可以取得较好的染色效果。4.3不同条件下Giemsa-Wright混合

19、染液染色效果 比较采用Giemsa-Wright混合染液,通过改变染色时间、染色温度,分色方式和分色时间、染液用量和浓度等染色条件,对血涂片进行染色。显微镜下观察染色效果。部分结果见表3，由表3可知,25下混合染液在以下三种染色条件下可以取得较好的染色效果:混合染液:缓冲液=l:2，25染10min水洗；适量混合染液25染10min,水洗；25染15min，50%乙醇洗5s。 第五章 讨 论血细胞形态结构的观察 ,是研究动物免疫的一个重要环节,血涂片染色的质量,直接影响到观察结果。正常情况下 ,染色时间与染液浓度、室温及细胞多少有密切关系, 即染液愈浓 , 室温愈低 ,细胞愈多 ,则所需的染色

20、时间愈长。因此要想染出结果比较理想的血涂片, 必须根据具体情况灵活掌握, 必要时冲洗前在低倍镜下观察有核细胞是否染色清楚,核着色是否分明【18】。4.1 Giemsa 氏染色法 Giemsa 氏染色法优点是从对血涂片的染色结果可以看到，细胞核染色清晰，细胞界限分明。由于 Giemsa 染液在染色过程中不会挥发，血涂片在染色过程中不易污染，染色过程易控制，染色效果对染液 pH 值要求高，对该血细胞的染色以 pH6.8染色效果最好；缺点是从结果可以看到，Giemsa 氏染色法对粒细胞细胞质中的颗粒成分的染色不是十分清晰，染色时间长。由于本实验也使用了以蒸馏水冲洗后，短暂地浸入加进几滴的碳酸锂的蒸馏

21、水中，以辨别染成红色的结构; 而以用水冲洗后，短暂地浸入加进几滴稀盐酸的蒸馏水中，以辨别染成蓝色的结构，但 Giemsa 氏染色法对粒细胞中的颗粒显示仍然不是十分理想，故在血涂片染色时不建议使用。4.2 Wright 氏染色法 Wright 氏染色法优点是从对血涂片的染色结果优点是从对血涂片的染色结果可以看到，对粒细胞质中的颗粒成分染色十分清晰，染色时间短，结果出现的快；缺点是对细胞核的染色不如 Giemsa 氏染色法染的清晰，细胞界限不清，再之，Wright 染色液中由于没有加入甘油，则易使染液挥发而造成血涂片的污染，从而使其染色过程不易掌握。由于该方法所使用的试剂配制简单，染色时间短等特点

22、，可以用于血细胞的染色和血细胞类型的辨别，尤其可以在实验教学中，用于血细胞的辨别。4.3 Wright-Giemsa 混合法 Wright-Giemsa 混合法优点是从血涂片的染色结果可以看到，Wright-Giemsa 混合法不仅对粒细胞的细胞核和细胞质中的颗粒成分着色清晰，同时细胞界限也较为分明，该方法起到了2 种染液互补的作用； 缺点，染液易挥发和变性快，易污染，为了避免该缺点，使用 Wright-Giemsa 染液时，第一，要在湿盒中进行; 第二，在滴染时要多加入几滴染液； 第三，在血涂片染色结束后，要尽快用水冲洗，用自来水冲洗要比用蒸馏水或缓冲液冲洗更方便和彻底，可通过调节自来水的水

23、压，及时冲去结合尚未牢固的染料沉渣，以减少污染。该法不仅可以广泛用于血细胞的染色和血细胞的类型识别，同时也可以在实验教学中广泛使用，是广泛研究血细胞的一个较好的染色方法。 笔者认为Wright-Giemsa混合染色法之所以染色效果较好 ,主要是因为Wright染色法对粒细胞的特异性颗粒着色性比姬姆萨染色法好, 但核的染色却不如姬姆萨染色法；而Giemsa萨染色法对细胞核着色较好 ,结构显示较清晰,而胞浆和特异性颗粒则染色较差。因此,采用Wright-Giemsa混合染色法可兼取二者之长,使血涂片染色效果更为理想。应注意的是玻片必须清洁, 配制染料需用优质甲醇,稀释染液需用缓冲液, 冲洗需用中性

24、流水 ,才能保证各种细胞着色正常。 第六章 结 论 通过实验和观察，我们发现Giemsa 染液染色时间较长，对细胞核染色效果较好，细胞质界限清晰，但对细胞质中的颗粒染色较差； Wright 染液染色时间较短，对细胞核和细胞质中的颗粒染色效果较好，但细胞质的界限不淸; Giemsa-Wright 混合染色具备了两种染液的优点，时间介于两者之间，细胞核和细胞质中的颗粒染色效果较好，细胞界限清晰，该法可用于血细胞中的广泛研究【19-20】。通过实验还发现对于血细胞的着色,染液的浓度对染色结果影响很大。染色时应先滴加缓冲液,再滴加染液,以避免细胞染色过深。对于染色后的分色,如果用95%的乙醇分色,其脱

25、色效果过强,一般不推荐使用；用50%乙醇分色,其脱色效果适中,可供调节的范围较大,是首选分色剂；而用缓冲液分色的效果不很理想,细胞类型区分不够鲜明。附 图 表 图版：血细胞染色方法的比较表1 38不同染色条件下姬姆萨染液部分染色结果染色程序颗粒着色细胞核着色细胞质着色备注染色30min,95%乙醇浸泡5s紫红/红淡蓝/淡蓝紫无色部分细胞颗粒染色过度,将核掩盖染色30min,50%乙醇浸泡5s红蓝包蓝紫色微红三种细胞类型可以较好区分染色2min,50%乙醇冲洗分色红包淡紫天蓝色/蓝色微蓝/无色三种细胞类型可以较好区分染色20min,50%乙醇浸泡分色5-9s红包深红紫红微蓝部分细胞颗粒染色过度,

26、将核掩盖染色20min,PBS分色1min红紫红/红淡红脱色较好染色20min,PBS分色2min紫红/红紫/红淡红脱色较好适量染料,染20min,水洗红/红黑天蓝/紫红淡红部分细胞颗粒染色过度染色10min,水洗红/红黑天蓝/蓝紫微蓝三种细胞类型可以较好区分表2 25不同染色条件下瑞氏染液部分染色结果染色程序颗粒着色细胞核着色细胞质着色备注染色10min,水洗红或红黑深红淡红颗粒染色过深染色10min,50%乙醇分色5s红包淡紫色蓝色/天蓝微红分色稍过度染色15min,50%乙醇分色5s深红包红色蓝色/天蓝微红三种细胞类型可以较好区分染色15min,95%乙醇分色5s鲜红/紫红蓝色微紫三种细

27、胞类型可以较好区分表3 25不同染色条件下混合染料部分染色效果染色程序颗粒着色细胞核着色细胞质着色备注染色10min,水洗红黑/红红褐色淡红染色过深适量混合染液1:2,染10而n,水洗红/淡紫淡蓝色微红染色过浅1:2,染10而n,水洗红/紫红蓝紫色淡紫部分细胞的颗粒将核掩盖适量混合染液染色10而n,水洗红/紫红蓝/蓝紫淡红/淡紫部分细胞的颗粒将核掩盖染色10而n,50%乙醇分色5s红/紫红蓝紫淡紫部分细胞的颗粒将核掩盖染色15而n,95%乙醇洗55淡红/无色淡紫微紫分色过度参考文献1周永灿,邢玉娜,冯全英等.鱼类血细胞研究进展J.海南大学学报(自然科学版),2003,21(2):171-176

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