芹菜叶中提取黄酮类化合物

1、安徽工程大学 食品科学与工程061 陶然 第一章 芹菜(Apium graveolens L. )是一种草本植物， 二年生、伞形科芹菜属，自然资源丰富。芹 菜叶作为芹菜原料的边角料通常没有得到充 分的利用，但其中含有以芹菜素为主的黄酮 类化合物，具有保护血管、增强免疫力，降 压安神、降血脂、镇静健胃、抗氧化、抗衰 老，增强机体免疫力等功能，以及广泛的生 物活性和重要的药用价值。作为天然抗氧化 剂，黄酮类化合物一直备受人们的关注，因 此研究提取和测定芹菜叶内的黄酮类物质， 具有一定的实用价值。 超声波辅助提取的原理 超声波萃取中的优越性，是基于超声波的 特殊物理性质。主要是通过压电换能器产 生的

2、快速机械振动波来减少目标萃取物与 样品基体之间的作用力从而实现固-液萃 取分离。 （1）加速介质质点运动 （2）空化作用 （3）超声波的振动匀化 第二章 试验方法 工艺流程 芹菜叶预处理 标准曲线的确定 样品总黄酮的测定 单因素试验 正交试验 稳定性的研究 红外光谱扫描 工艺流程 新鲜芹菜叶清洗切碎预 处理加入溶剂提取超声波 控制提取浓度控制提取时 间控制提取温度控制料液 比收集上清夜稀释测量 吸光值正交试验确定最优 提取条件 2.1芹菜叶的预处理 芹菜叶粉碎按 1 20料液比加无水乙 醚40冷凝回流2小 时脱脂过滤滤渣干 燥后备用。 2.2标准曲线的确定 准确称取芦丁20mg(120烘至恒重

3、),加95% 乙醇水溶液50 mL。准确吸取0、1、2、4、 6、8、10、12mL于50mL容量瓶中,加12mL 95%的乙醇,加含5% NaNO2水溶液2mL,摇 匀静置6min,再加含10% Al(NO3)3水溶液 2mL,摇匀静置6min,再加含5% NaOH水溶液 20mL,用95%乙醇水溶液稀释至刻度,摇匀, 在490510 nm波长范围内扫描,确定最大吸 收波长;在最大吸收波长(510nm)处测定吸光 值。以吸收度Y为纵坐标,浓度x为横坐标,进 行回归分析,绘制回归曲线。 2.3样品总黄酮得率的确定 以芹菜叶为原料,经乙醇浸提总黄酮,提取 液过滤离心后定容至50mL,每次准确量取

4、 1.0mL。代入回归方程中计算,得出提取 液中总黄酮含量。 总黄酮的得率%=C50/(W1000)100 2.4单因素试验 选择提取乙醇浓度、超声 功率、超声提取温度、料 液比、超声提取时间进行 单因素试验,考察其对提 取率的影响。 2.5正交试验 根据单因素试验结果, 选择超声功率、超声提 取温度、料液比、超声 提取做4因素3水平正 交试验,确定最佳提取 条件。 2.6稳定性试验 分别取少量芹菜叶黄酮的提取液进行日光、 自然光、避光、加热时间、加热温度、 pH、Vc的稳定性实验,在510 nm处测其 吸光度,根据芦丁标准曲线的回归方程计 算总黄酮含量,由此判断芹菜叶黄酮的光 及热稳定性。

5、芹菜叶总黄酮保存率(%)(处理后溶液中 总黄酮含量/处理前溶液中总黄酮含 量)100 2.7红外光谱扫描 取少量芦丁粉末与少量在 最佳提取条件下干燥后的 粉末进行压片，进行红外 扫描。 第三章 3.1吸光度标准曲线的确定 3.2 单因素试验 乙醇浓度 超声波功率 超声波时间 提取温度 料液比 3.2.1乙醇浓度对得率的影响 准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0.5 g,分别 加入50mL的水以及不同浓度的乙醇在 60下浸提2h过滤,滤液按方程测定总黄 酮提取率。实验结果如图3-2所示。结果 表明,在较低浓度条件下,随着乙醇浓度的 增加,芹菜叶总黄酮的提取率逐渐提升,到 65%的乙醇为溶剂时,总黄酮的提

6、取率达 到峰值,之后,总黄酮的得率随着乙醇浓度 的增加而降低。因此,选择65%乙醇为最 佳溶剂浓度。 3.2.1乙醇浓度对得率的影响 3.2.2功率对得率的影响 准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5g，加入 40mL65%乙醇,在60下超声功率分别为0、 50W、60W、70W、80W、90W和100W时 超声提取10min，过滤，滤液按方程(2)测定 总黄酮提取率。实验结果如图所示。结果表 明随着使用超声波辅助提取,总黄酮的提取率 在增加，而到50W之后，总黄酮提取率随着 超声功率的增大而降低。因此50W为最佳提 取功率。由于试验仪器的影响，最低的超声 波提取功率只能设定在50W。 3.2.2

7、功率对得率的影响 3.2.3超声波时间对得率的影响 准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5g，加 入40mL 65%乙醇,在60、超声功率为 60W时分别超声提取5min、10min、 20min、30min和40min，过滤，滤液按 方程(2)测定总黄酮得率。实验结果如图 3-4所示。结果表明，随着时间的增加,总 黄酮提取率增加,但在10min时候达到峰值， 之后随着时间的增加,总黄酮提取率降低。 所以选择10min为最佳的提取时间。 3.2.3超声波时间对得率的影响 3.2.4提取温度对得率的影响 准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5 g，加 入40mL 65%乙醇,分别在20、40、 50、6

8、0、70和78下，超声功率 为60W时超声提取10min,过滤,滤液按方 程(2)测定总黄酮得率。实验结果如图3-5 所示。结果表明,超声提取温度为20至 60时,总黄酮得率随着温度的升高而增 加,而60之后随着温度的升高,总黄酮提 取率降低。因此,选择60为最佳的超声 提取温度。 3.2.4提取温度对得率的影响 3.2.5料液比对得率的影响 准确称取脱脂后的芹菜叶粉末0. 5g，分 别加入65%乙醇10mL、20mL、30mL、 40mL和50mL，在60、超声功率为 60W时超声提取10min,过滤,滤液按方程 (2)测定总黄酮得率。实验结果如图3-6所 示。结果表明,总黄酮提取率随料液比

9、增 大而增大,在料液比为1 80时为最大值, 随后减小。 3.2.5料液比对得率的影响 3.3正交试验 为了全面考察超声波辅助提取的最佳工艺参数， 在单因素实验的基础上,选择65%乙醇为最佳提 取溶剂,以超声功率,超声提取温度,料液比和超 声提取时间这4种因素进行L9(34)正交试验，确 定最优方案，结果见表3-1。从表中极差数据可 知,超声功率,超声提取温度,料液比和超声提取 时间这4种因素对总黄酮提取率影响的主次顺序 为：料液比超声波提取温度超声提取时间超 声提取功率，最佳的提取条件为65%乙醇浓度， 超声功率为55W，超声提取温度为50，料液 比为1 80，超声提取时间为10min，最佳

10、提取 条件下所得的黄酮类化合物的得率为0.221%。 2.5正交试验 根据单因素试验结果,选择超声功率、超 声提取温度、料液比、超声提取做4因素 3水平正交试验,确定最佳提取条件。正交 试验因素和水平见表2-1。 水平水平A超声波超声波 功率功率/W B提取温提取温 度度/ C料液比料液比/g： mL D超声波超声波 时间时间/min 150501:705 255601:8010 360701:9015 正交试验 试验号试验号ABCD黄酮得率黄酮得率/% 1 1111 0.193 2 1222 0.188 3 1 333 0.148 4 2123 0.199 5 2231 0.148 6 23

11、12 0.193 7 3132 0.181 8 3213 0.134 9 3321 0.208 K1 0.5290.5730.5220.549 K2 0.5410.4710.5950.563 K3 0.5240.5500.4780.482 k1 0.1760.1910.1740.183 k2 0.1800.1570.1980.187 k3 0.1740.1830.1590.161 极差R 0.0050.0340.0390.027 因素主 次 料液比提取温度超声波提取时间超声波功率 最优方案 55W5080min10min 2.5正交试验 从表中极差数据可知，超声功率，超声提 取温度，料液比和超

12、声提取时间这4种因 素对总黄酮提取率影响的主次顺序为：料 液比超声波提取温度超声提取时间超 声提取功率，最佳的提取条件为 A2B1C2D2，即65%乙醇浓度，超声功率 为55W，超声提取温度为50，料液比 为1 80，超声提取时间为10min，在此 最佳提取条件下所得的黄酮类化合物的得 率为0.221%。 3.4稳定性的研究 光照对黄酮类物质的影响 加热时间对黄酮类物质的影响 pH对黄酮类物质稳定性的影响 3.4.13.4.1光照对芹菜叶黄酮稳定性的影光照对芹菜叶黄酮稳定性的影 响响 分别准确称取3份芹菜叶粉末0.5g，于正 交试验最佳提取条件下进行提取，定容后 按标准方程测其初始吸光度，并将

13、装有提 取液的3支容量瓶，1支置于日光下照射， 另2支分别在室内自然光下和暗箱药品柜 中放置,每隔1d测其吸光度，共测定4次， 并将每天测得的吸光度值与初始吸光度对 比分别计算，得出黄酮的保存率含量。 3.4.1光照对芹菜叶黄酮稳定性的影响 3.4.1光照对芹菜叶黄酮稳定性的影响 由图3-7可知，黄酮提取液在日光、自然 光、避光下放置2d，其黄酮提取液保存 率分别为93.6%，94.3%，94.3%，放置 4d，其黄酮保存率分别为81.5%，87.2%， 91.5%。可见，日光对芹菜叶中黄酮稳定 性有一定影响,自然光对芹菜叶中黄酮的 稳定性影响不大,避光条件下芹菜叶中黄 酮的稳定性较好。 3.

14、4.23.4.2加热时间对黄酮稳定性的影响加热时间对黄酮稳定性的影响 准确称取芹菜叶粉末0.5g，于正交试验最 佳提取条件下进行提取，定容后按标准方 程测其初始吸光度，并将装有提取液容量 瓶放在水浴锅中进行加热，分别在20、 30、40、50、60、70、80、 90测量其吸光度，与初始吸光度对比 分别计算，得出黄酮的保存率含量。 3.4.2加热时间对黄酮稳定性的影响 3.4.2加热时间对黄酮稳定性的影响 由图3-8可知，在2060下，热对芹菜 黄酮的稳定性几乎没有影响，在70是 保存率为78.3%，在70以上时分解加速， 90时保存率为58.9%。说明高温对芹菜 黄酮稳定性具有影响。 3.4

15、.3pH对芹菜叶黄酮稳定性的影响 以柠檬酸-柠檬酸钠为缓冲体系，研究了 不同pH值对芹菜叶总黄酮热稳定性的影 响。实验结果见图3-9。由图可见，芹菜 总黄酮的热稳定性随pH值增大而减弱。 因此，在利用芹菜总黄酮加工保藏食品时， 在食品感官品质允许的情况下，应尽量采 用较低的pH值。 3.4.3H对芹菜叶黄酮稳定性的影响 3.5红外扫描光谱 3.5红外扫描光谱 芦丁的结构中含有各种具有红外吸收的官 能团，其中-OH基团在36503500cm-1 处峰形尖，吸收强。当-OH基团浓度大时， 波峰移至35003200处，峰形较宽。其 中的芳环在16201480cm-1处具有4个波 峰，15001480

16、 cm-1最强，1620 1590 cm-1其次，1580 cm-1较弱，450 cm-1常观测不到。-C=O基团在1600 1850 cm-1具有吸收峰。-CH基团在 27003000 cm-1具有吸收峰。 3.5红外扫描光谱 由图3-10可知，在32003500 cm-1处，具 有较强的吸收值且波形较宽，说明有大量- OH基团存在。在14711519 cm-1处具有一 个明显的吸收峰，说明物质中含有芳环。在 18562956 cm-1处有一个较小的吸收峰， 说明有-CH键的存在。在1647 cm-1处具有一 个吸收峰，说明有-C=O基团存在。 图中粗品的曲线的吸收峰在32003500 cm- 1处、14711519 cm-1处、18562956 cm- 1处、1647 cm-1处同样出现，但峰形并没有 芦丁曲线尖，说明次样品中含有黄酮类物质。 3.5红外扫描光谱 3.5红外扫描光谱 由图3-11可知，图中正交后的曲线在 32003500 cm-1处、14711519 cm-1 处、18562956 cm-1处、1647 cm-1处 仍然出现波峰，说明正交后样品中含有黄 酮类物质，并且在正交干燥后的样品中的 黄酮已经被提取走，较原先的含量已明显 减少，证明超声波辅助提取技术有效的增 加的黄酮类物质的