食品中铜绿假单胞菌检测

1、食品中铜绿假单胞菌检测 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 食品中铜绿假单胞菌检测 一、概 述 铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）俗称绿脓杆菌， 因为在代谢过程中产生水溶性的绿色色素，使伤 口与创面呈绿色，故名绿脓杆菌。 铜绿假单胞菌能在许多污染物质中存活并繁殖， 生长营养需求不高，善于利用各种碳源和氨化合 物作为氮源，在水、土壤、食品以及医院等环境 广泛存在，甚至在蒸馏水、消毒液也不例外，如 季铵类消毒液，特别是含有一些有机物的液体。 食品中铜绿假单胞菌检测 铜绿假单胞菌可由多种途径传播，但主要是通过 污染医疗器械、用具及带菌医护人员引起医源性 感染，因此，对烧伤病房、手术器械及治疗器械 应进

2、行严格消毒灭菌，以保证无铜绿假单胞菌的 污染。对铜绿假单胞菌感染的治疗，可应用庆大 霉素、多粘菌素B和羧苄青霉素。 铜绿假单胞菌抵抗力较其他革兰阴性菌强， 561h可杀灭，对很多抗生素具有耐受性。对消 毒剂、干燥、紫外线等理化因素及不良环境抵抗 力强，对化学药物的抵抗力比一般革兰氏阴性菌 强大。 食品中铜绿假单胞菌检测 二、生物学特性 1. 培养特性 本菌属于假单胞菌属，是一种 非发酵革兰阴性无芽孢杆菌，菌体 细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或 短链状排列。菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显 微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。 2菌体形态 无芽孢，无夹膜，革兰阴性杆菌，有单鞭毛 或丛

3、鞭毛，运动活泼。菌体的大小为0.5 1m1.53.0m，菌体笔直或弯曲。 食品中铜绿假单胞菌检测 3、生化特性 氧化酶和过氧化氢酶阳性。O/F试验为氧化型， 还原硝酸盐为亚硝酸盐，分解乙酰胺产生氨。 98 菌株产生水溶性荧光色素。铜绿假单胞菌能 液化明胶，酪蛋白水解，但淀粉不水解。90 以 上的菌株产生蓝绿色色素。 分解蛋白质能力强，发酵糖类能力较低，氧化分 解葡萄糖，产酸不产气，不分解甘露醇、乳糖及 蔗糖，能液化明胶，分解尿素，不形吲哚，氧化 酶试验阳性，还原硝酸盐产气，靛基质阴性，不 产硫化氢。 食品中铜绿假单胞菌检测 三、致病性 主要致病物质是内毒素，此外尚有菌毛、荚膜、胞外 酶和外毒素

4、等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症 ，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内 膜炎 、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严 重的流行性腹泻。 WHO的HACCP评估明确指出铜绿假单胞菌是婴儿瓶装 饮用水的危害指示菌，可造成婴儿腹泻。尤其是抵抗 力较差的老弱病幼孕人群，饮用含铜绿假单胞菌的瓶 装水很可能导致疾病的发生，患者食入103104个菌体细 胞即可被侵害。铜绿假单胞菌的生长还将增加亚硝酸 盐的含量-参考文献。 食品中铜绿假单胞菌检测 国内外污染情况- 参考文献 国内污染情况： -瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率1.223.6； -瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率11.6。

5、国外污染情况： -Richards等在104件检品中的4件分离到铜绿假单胞菌； -Rosenberg报告德国1.210.2的瓶装矿泉水检出铜 绿假单胞菌。 刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报 道5加仑桶装产品（1531天的保存期），铜绿假单胞 菌可生长繁殖达到 CFU/ml。 国内卫生标准：0 CFU/250ml 食品中铜绿假单胞菌检测 三、实验室检验 GB/T 8538-2008 铜绿假单胞菌检测（滤膜法） 食品中铜绿假单胞菌检测 原 理 将250mL水样用孔径为0.45m的滤膜过滤， 并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36士1恒 温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿 脓

6、菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈 阳性、紫外光（36020nm）照射下能发荧光、 能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌， 经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。 食品中铜绿假单胞菌检测 培养基和试剂 假单胞菌琼脂基础培养基/CN琼脂（低温避 光保存） 金氏B 培养基（低温避光保存） 乙酰胺肉汤 营养琼脂 氧化酶试剂 钠氏试剂（配制好之后低温避光保存） 食品中铜绿假单胞菌检测 设备和仪器 玻璃器具：所有玻璃器皿使用前需121高 压蒸汽灭菌15分钟 恒温培养箱：361 紫外灯：波长应为36020nm 滤膜：直径47mm，微孔径为0.45 （处理方法： 如滤膜未经灭菌，则使用前需先

7、将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌3次，每 次15 min。前两次煮沸后需更换水，用蒸馏水洗涤2次3次，以除去残留溶剂。建议使用一次性无 菌滤膜。） 显微镜：10100 冰箱：08 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 操作步骤-水样过滤 在100级的洁净工作台进行过滤操作。 首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分， 将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上， 固定好滤器，将250mL水样或稀释液通 过孔径0.45m的滤膜过滤，然后将过滤 后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上， 平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着 气泡。 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜

8、绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 结果观察 培养20h24h观察滤膜上菌落的生长 情况并计数，防止因为培养导致菌落过分 生长而出现菌落融合。（ 40h48h时更 容易观察产色素情况和荧光情况）。 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 可疑菌落计数情况 计数所有显蓝色或绿色（绿脓色素）的菌落，初步 判定为铜绿假单胞菌。 计数滤膜上所有发荧光不产绿脓色素疑似铜绿假单 胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。 （在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光 下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导 致无法在证实培养基上生长。） 将其它所有红

9、褐色不发荧光的菌落进行氧化酶试验、 乙酰胺肉汤、金氏B培养基确证实验。 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 纯 化 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接 种营养琼脂培养基，于361培养 20h24h，对可疑菌进行纯化。 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 将最初显红褐色的菌落进行氧化酶试验 氧化酶试验 ： 原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统 的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧 化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的 醌类化合物。 操作：取23滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的 洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种

10、培 养物涂布在预备好的滤纸上。在10秒内显深蓝紫色的视为 阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进 行该项测试。 食品中铜绿假单胞菌检测 产氨实验（乙酰胺肉汤） 原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使 乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加钠氏试剂 （碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作 用，生成红色的络合物。 操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试 管中，在361下培养20h24h。然后向 每支试管培养物加入12滴钠氏试剂，检查各 试管的产氨情况，如表现出从深黄色到砖红色 的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 产荧光素实验（金氏B培养

11、基） 原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素 的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为 荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是 培养基的凝固。 操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳 性的培养物接种于金氏B培养基上，于 361恒温箱培养24h5d。 每天需取 出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将 5d内产生荧光的菌落记录为阳性。 食品中铜绿假单胞菌检测 食品中铜绿假单胞菌检测 计数结果说明 菌落计数公式： NPF(cF/nF)R(cR/nR) P是呈蓝/绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞 菌的菌落）。 F是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。 R是呈红褐色的菌落数。 nF是进行产氨测试的显荧光菌落数。 c

12、F是产氨阳性的显荧光菌落数。 nR是进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光 测试的红褐色菌落数。 cR是产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试 均呈阳性的红褐色菌落数。 食品中铜绿假单胞菌检测 举 例 N=17+16(2/5)+10(3/5) 17：呈蓝/绿色的菌落数； 16：没有绿脓色素但显荧光的菌落数； 2：产氨阳性的显荧光菌落数； 5：进行产氨测试的显荧光菌落数； 10：呈红褐色的菌落数； 3：产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测试均 呈阳性的红褐色菌落数； 5：进行产氨、氧化酶、金氏B培养基上显荧光测 试的红褐色菌落数。 食品中铜绿假单胞菌检测 样品稀释 若样品污染严重，建议对样品进行稀 释，如10倍递增稀释：取30ml样液加入 至270m