001-经口急性毒性试验方法-改良寇氏法

1、WORD格式整理急 性 毒 性 试 验 方 法改良寇氏法Krber法由Krber于1931提出，后经Finney改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD50及全部有关参数与正规概率单位法相近。改良寇氏法（Kber）试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数的动物死亡率在10%50%之间，另一半在50%100%之间，最好出现0 %和100 %的剂量组。一、剂量选择及分组1、剂量选择 剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。探求外源化学物的急性毒性，测定其LD50

2、或LC50时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD50的计算方法，然后设计剂量。2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部致死的最小剂量（b）和全部不致死的最大剂量（a），即求出待测化学物0 %100 %的大致致死剂量范围，然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计57个剂量组，组间剂量呈等比级数（r），其比值为1.21.5。进行正式实验。用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180200g，小鼠1822g，豚鼠200250，家兔22.5kg，犬10

3、12 kg。用于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的20%。仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。当预试中发现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD50。通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。按下式设计剂量组： 式中：r相邻两组剂量的比值，一般为1.21.5，b最低全致死剂量量，a最高不致死剂量，n设计的组数。分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。因为组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较精确求出LD50。3、根据公比(

4、r)计算各组剂量各组剂量分别为：第一组：a第二组：a r 第三组：a r2 第四组：a r3第五组：a r4 第六组：a r5 二、受试物溶液配制1、溶剂的选择 毒理学试验中，常用的剂型有液体剂型、固体剂型。液体剂型中有溶液剂、混悬剂、乳化剂等。选择溶剂的原则是不与受试物发生化学反应，不改变化学物的毒性，故应根据受试物的理化性质，选择适当的溶剂。一般而言，水溶性化学物可选择蒸馏水或生理盐水，以水为溶剂，既经济、方便、易吸收，又无毒副作用。脂溶性化学物多选用植物油，如花生油、橄榄油。不溶于水而溶于油的化学物常用吐温-80或吐温-60配制成乳化剂。既不溶于水又不溶于油脂的化学物可选择淀粉液、明胶液

5、、羧甲基纤维素钠液（0.5-1% CMC）等助悬剂配制成混悬液。如用有机溶剂，实验动物应设溶剂对照组，有机溶剂所用比例不宜超过10%，溶解后，再用水稀释，必要时可加入增溶剂，如吐温-80、聚乙二醇等，以提高溶液剂的浓度。2、配制方法 受试化学物的配制方法有等浓度稀释法和等容量稀释法。等浓度稀释法 将受试物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小。比如某受试物的试验剂量分别为100、200、400和800mg/kg，受试物配制成10 mg/ml，每组动物每10g体重分别给与0.1、0.2、0.4和0.8 ml。等容量稀释法

6、将受试物配制成不同浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓度越高。上例中，若实验动物按0.2ml/10g b.w容量灌胃,则应配制成4个不同浓度,即5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml和40mg/ml。灌胃体积依所选用的实验动物而定，一次灌胃的体积为：小鼠0.10.4ml/10g b.w，每只不超过1ml；大鼠0.51ml/100g，每只不超过4ml;家兔在5ml/kg之内;犬不超过50ml/kg；为避免操作误差，等容量稀释的传统方法常采用1K系列稀释法。该法操作简便、浓度精确、节约受试化学物。a、 确定各剂量组所需受试液浓度如已知最高剂量组剂

7、量为2000mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法给予受试药液，即0.2ml/10g b.w.，相当于20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为2000 mg/20ml，即10.0%（C1）。b、 确定每组所需受试液的量（m ml）按每只鼠体重25g计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w.，则每组10只动物所需受试液的量为5ml；c、 确定母液总量配制时，根据实验设计要求确定最高剂量组所需受试化学物的浓度和总体积，配制母液。设母液浓度为C1，各组所需要的量为m ml，母液应配制的总量M用下述公式计算： 式中， K为各组剂量的比值，K=1/r

8、。d、 配制母液选择适当的溶剂配制浓度为C1的受试液，取M ml作为母液，从母液中取出m ml供最高剂量组染毒用；然后取m ml溶剂加入剩余的母液中，混匀，稀释后的母液浓度为C2（C1 ：C2=1：k= r），即次高剂量组所要求的浓度，从中取出m ml供次高剂量组染毒用（第2组），然后再加入m ml溶剂，其稀释后的浓度为C3（C2 ：C3=1.2），取出m ml供第3组动物染毒用。依此类推，可配制成按1K递减的各剂量组不同浓度的试液。三、染毒各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.。四、观察指标与试验期限急性中毒症状及出现时间，死亡数量、时间。大体剖检变化

9、。试验期限为7-14天五、结果及LD50的计算采用寇氏法计算LD50及其95%可信限1、试验结果列表表 试验结果组别剂量（mg/kg）试验动物数死亡动物数死亡率（p）存活率（q）1102103104105102 计算LD50当急性毒性试验的最大剂量死亡率为100%，最小剂量的死亡率为0%；各组动物数相等；各剂量组的组距等比或剂量对数等差时，用下述基本公式计算LD50：当不含0%和100%死亡率时，用下式计算LD50：以上各式中：i组距，即相邻两组剂量对数剂量之差Xm最大剂量对数P各剂量组死亡率(死亡率均用小数表示)Pm最高死亡率q各组剂量存活率，q=1-pPn最低死亡率p各剂量组死亡率之和n各

10、组动物数Sx50logLD50的标准误LD50 的95 %可信限=log-1(log LD501.96Sx50) 改进Krber法的优点是计算简便、结果精确，实用性大。我国新兽药一般毒性试验技术要求规定用此法计算新兽药的LD50。举例：给小鼠口服某药进行急性毒性试验，测定LD50。选择体重1824g健康小鼠（雌雄各半），按随机方法将动物分为5个组，每组10只。经预试找出死亡率在0100%的剂量范围大约为300600mg/kg b.w. 。（1)预试（略）（2） 计算公比 r= 5-1 600/300 =4 2 =1.189 1.2 ?（3） 根据公比(r)计算各组剂量因而各组剂量分别为：第一组

11、：a=300mg/kg b.w.第二组：a r =3001.2 = 360mg/kg b.w.第三组：a r2 =3001.2 2 = 432mg/kg b.w.第四组：a r3 =3001.2 3 = 518mg/kg b.w.第五组：a r4 =3001.2 4 = 622mg/kg b.w.（4） 受试液配制采用1：K系列稀释法配制不同浓度的受试液。（K1/r）a、 确定各剂量组所需受试液浓度：已知最高剂量组剂量为622mg/kg b.w.，小鼠按等容量方法给予受试药液，即0.2ml/10g b.w.，相当于20ml/1000g b.w.，故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为622

12、 mg/20ml，即3.11%（C1）；b、 确定每组所需受试液的量按每只鼠体重25g计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w.，则每组10只动物所需受试液的量为5ml；c、 确定母液总量各组动物需用本组浓度受试液的用量为5 ml（m）；各剂量组之比为0.833（k=1/ r），则母液应配制的总量为（ml）：=29.999930（ml）51-0.833d、 配制母液选择适当的溶剂配制浓度为3.11%（C1）的受试液，取30 ml作为母液，从母液中取出5ml供第五组（最高剂量组）接毒用，然后取5 ml溶剂加入25ml母液中混匀，稀释后的母液浓度为2.59%（C2）（C1 ：C

13、2=1：k=1.2），即第四组（次高剂量组）所要求的浓度，从中取出5 ml供第四组接毒用，然后再加入5 ml （n ml）溶剂，其稀释后的浓度为2.16%（C3）（C2 ：C3=1.2），即第三组所需的浓度。依此类推，可配制第二组、第一组所需浓度的受试液，分别为1.80%、1.50%（5） 接毒各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.。（6） 观察指标（7） 结果及LD50的计算采用寇氏法计算LD50及其95%可信限a、将试验结果列入下表，按改良寇氏法进行计算；表 试验结果组别剂量（mg/kg）试验动物数死亡动物数死亡率（p）存活率（q）130010001.023601020.20.834321050.50.545181070.70.3562210101.00b、按下列公式计算：即：logLD50=Xm-d（p-0.5）Xm=log622=2.7938i=log 1.2=0.0792p=0+0.2+0.5+0.7+1.0=2.4代入公式：logLD50= 2.7938-0.0792（2.4-0.5）=2.6433c 查反对数求出