HIV实验室质量管理

1、艾滋病实验室质量管理 实验室质量管理 行政支持 行政部门和领导 HIV实验室建设和发展 资金 人员 监督支持 人员培训 每年市疾控中心组织 上岗证 环境条件：实验室的设置及其建筑、设施、设备必须 符合全国艾滋病检测工作管理办法的要求。HCV， HBV及梅毒等血清学检测在满足实验室管理要求和保证 生物安全的条件下，可以与HIV检测共享空间和设备， 应避免交叉污染。 实验室质量管理 样品采集、运送和处理 送检单 收样登记表 HIV抗体复检检测单 检测方法和试剂的选择 试剂的出入库及使用记录 供应品、耗材（试剂）质量验收记录表 实验室质量管理 设备维护与校准 仪器设备温度记录表 仪器设备使用、检定、

2、维修、维护记录本 强检计量器具周期检定（自校）计划表 文件和文件管理 实验原始记录表 结果报告 样品登记和保存（唯一编码） 实验室质量管理 文件和文件管理 标准操作程序（SOP）（1）样品的接收、登记、处理、保 存和运输；（2）检测方法和步骤；（3）试剂使用和保存； （4）仪器的使用维护和校准；（5）质量控制要求及程序； （6）结果解释与报告；（7）保密程序；（8）实验室数据、 相关文件记录与保存；（9）不确定样品追踪和处理；（10） 实验室安全防护及实验室的清理和消毒。 文件存档（保存10年以上） ELISA实验影响因素 酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素 样品 溶血标本及混有红细胞的

3、血清采用ELISA法检测易产生假阳 性 可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋 白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它 可使过氧化氢释放出原生态氧，从而催化底物四甲基联苯胺 生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性。轻微溶血 没事，严重溶血的标本易产生假阳性。 受细菌污染的标本因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶， 因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异 性显色而干扰测定结果。 酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素 样品 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样 本内抗原含量下降造成假阴性 ，最好使用真空采血管或 抗凝管。（抗凝剂会略有影响，

4、但影响不大） 标本凝固不全 在工作中，有时为了争取时间快速检测， 常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清 中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成 肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液 标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。 酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素 按说明书要求，实验前应取出试剂稳定 加样 加样的量要准确 移液器要经常清洗 定期校准 加样位置 孔壁1/3以下 不可溅出 不可产生气泡 必须使用一次性TIP头，严格控制，防止交叉污染 先加稀释液的，加样时可用移液器孔内吹打混匀 移液器的校准 可以送检，可以自校，自校要有SOP有记录 酶联免疫吸

5、附实验（ELISA）的影响因素 孵育 时间 严格按照试剂盒说明书操作 容易控制 温度 严格按照试剂盒说明书操作 用校准的温度计监测温 度，特别是冬天，避免因温度过低导致假阴性。 封板 孵育时不贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附 于孔壁,难以清洗彻底。 恒温孵育设备的使用与维护 校准的温度计监测ELISA反应温度 水浴的尤其要注意水位 酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素 洗板 洗液的量 试剂不同，板孔的大小差异会导致洗液的量 的不同，为保证洗的彻底，原则是量足够多且不会逸出。 浸泡时间 严格按照试剂盒说明书操作，一般30-60秒， 不设置浸泡时间或时间太短，洗脱不彻底的话会产生 “花板

6、”。 保持针孔通畅不阻塞 血清中残留的的纤维蛋白丝或洗 涤液析出的结晶易使洗板机的针孔处于阻塞状态，造成 未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”。应做好洗板 机的维护工作。 拍板 酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素 洗板机的检定、使用及维护 检定：注液量和残留量（每孔5微升） 使用：设置程序（注液量、洗板次数、浸泡时间、洗 板位置） 维护：消毒液冲洗，蒸馏水冲洗 酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素 显色 加底物时，应悬空加液，避免触及板孔内壁造成交叉污 染。 应先加底物缓冲液A再加TMB(四甲基联苯胺)底物B，加入 顺序不能颠倒。已显浅蓝色的TMB底物坚决不能用。 个别试剂要求A、B

7、液先混合后再加。 温度与时间的控制。 酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素 终止及读板 读板前应保证板孔底部干净，无异物，无水气，无气泡， 特别是在冬天。 酶标仪不应放置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在 15-30,使用前先预热15-30 min,测读板结果会更稳定。 酶标仪必须检定 标准板厂家 酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素 Cutoff值计算及结果判定注意事项 严格按照试剂说明书要求的数量做阴、阳性对照 根据阴、阳性对照的值判定实验是否成立 严格按照试剂说明书要求计算Cutoff值 注意空白 原始记录 标明空白对照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及 待检样品的位置 试剂盒厂

8、家、测定方法、批号、效期 操作人员和复核人员姓名（签名） 检测日期 其他（环境、设备、实验依据等） 注意样本的溯源性 废弃物处理 消毒液（含氯消毒剂、75%乙醇、2%戊二醛） 干烤消毒（140 2-3h） 高压蒸汽消毒（121 15-20min） 高压灭菌器检定：温度和压力 高压灭菌器使用效果监测：化学指示卡，生物监测（嗜热 脂肪杆菌芽孢） ELISA实验质量控制 ELISA的质量控制 试剂盒内部对照：试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的 阳性和阴性对照血清。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有 效性，但不能作为室内质控品使用。每一次检测临床样品时， 必须有试剂盒内部对照，而且只能在同批号的试

9、剂盒中使用。 内部对照结果无效，必须重新试验。 室内质控品：为非试剂盒组份的外部质控品，是为了监控检测 的重复性而设置的，包括强阳性、弱阳性和阴性质控血清。也 可以只设置一个弱阳性质控，以该试剂盒临界值（Cut-off）的 23倍为宜。外部质控品的作用是，判断该批临床样品检测的 有效性，因此，每次实验必须包含室内质控品，其结果无效， 必须重新试验。 室内质控品的来源 商品化的室内质控品 实验室自己制备（比较经济） 混合试剂盒内部对照血清，通过做实验确定阴阳性对照的混 合比例，混合，分装保存。 混合HIV抗体阳性人血清、HIV抗体阴性人血清，3000转/分钟 离心15分钟，0.2m生物滤膜过滤除

10、菌，5630分钟加热灭活 处理。通过做实验确定阴阳性血清的混合比例，混合，分装 保存。 高浓度商品化室内质控品再稀释 室内质控品的保存 一次购买或制备量应该足够本实验室至少一年使用 等量分装，可以按单次使用、单日使用、最长一周使用的量确定 每个分装的量 不同室内质控品应做好标记，最好使用不同颜色的标签，以防止 混用 应存放于-70以下，如无条件则存放于非自动除霜的-20冰箱 一旦融解后应存放于2-8，一周后必须弃去，不能重新冻存使 用 样品的采集、处理、保存、运送及 接收 样品的采集和处理 建议用K2EDTA K3EDTA 枸橼酸钠的抗凝管采血,不用肝素 抗凝管采血 血浆 1500-3000r

11、/min离心15min，吸上层血浆 血清 室温自然放置1-2h，待血液凝固、血块收缩后1500- 3000r/min离心15min，吸上层血清 样品的保存 建议用1.5ml-2.0ml的螺口冻存管或离心管保存. 抗体及抗原检测的血清或血浆样品 应存放于-20以下, 一周内检测的样品2-8 样品的保存 尽量多分装保存 样品的运送要求 样本量1ml 样本的质量 无严重溶血，无微生物污染，无血脂过 多，无严重黄疸等 管子的质量 防漏 三层包装 单管包装 重新采样 样品的运送要求 样品和送检单分开 专人送样 专门运送箱（实验室人员号码和联系方式） 市疾控确证实验室 血清or血浆2-8度运送或者冻存状态

12、下直接运送 送样单要求 送样单打印 检测者/审核者手签，单位或实验室盖章 信息完整(真实姓名、送检人群、身份证号码、联系电 话、现地址及户籍地址等) 详细的样本来源(监管场所的具体到哪个监管场所) 充分利用备注栏 规范性(试剂、cutoff值等) 样品的接收 打开包装，注意生物安全，个人防护 核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏 记录 一般记录，另外记录有无严重溶血，微生物污 染、血脂过多及黄疸等情况 开盖 生物安全柜中，个人防护 HIV抗体检测 HIV抗体检测的目的 HIV抗体检测可用于诊断诊断、血液筛查血液筛查、监测监测等。 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括 临床

13、检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括 献血员筛查和原料血浆筛查。 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及变化 趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。 HIV抗体检测的要点 根据目的选择检测方法及检测策略。 严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。 筛查试验阳性，须做确证试验。 筛查试验阴性，不应做确证试验。 HIV抗体筛查试验流程 样 品 初筛试验初筛试验 筛查试剂 阳性反应阴性反应 复检试验复检试验 原有试剂+另一不同原理（或厂家） 试剂或另外两种不同原理（或厂 家）试剂 一阴一阳均阴性反应均阳性反应 确证试验 报

14、告阴性 筛查试剂 国家食品药品监督管理局注册批准 ELISA试剂批批检合格，在有效期内 推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂 初筛试剂 高敏感性 复检试剂 高特异性 筛查样品 血清 血浆 全血 DBS/DPS 唾液 尿液 筛查方法 酶联免疫吸附实验（ELISA） 第三代试剂 双抗原夹心法 单纯检测HIV抗体 第四代试剂 抗原抗体联合诊断试剂 同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体 缩短窗口期 注意复检试剂的选择注意复检试剂的选择 化学发光或免疫荧光试验 快速检测（RT） 筛查试验的结果报告 HIV抗体筛查试验阴性反应报告为“HIV抗体阴性” HIV抗体筛查试验阳性反应报告为“HIV抗

15、体待复检” HIV抗体复检试验两次检测均阴性报告为“HIV抗体阴 性” HIV抗体复检试验两次检测均阳性或一阴一阳报告为 “HIV抗体待确证” HIV感染产妇所生婴幼儿 婴儿会由于被动携带母亲的抗体而连续几个月至十几个月 出现抗体阳性。 婴儿满12个月进行第一次HIV抗体检测。使用两种不同原理 或不同厂家筛查试剂进行抗体检测，两种筛查试剂检测结 果均为阴性反应，报告HIV抗体阴性，可排除感染。检测结 果出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种 均阳性反应），不能排除感染，应继续追踪随访，至儿童 满18个月时再次进行HIV抗体检测。 HIV感染产妇所生婴幼儿 婴儿满18个月时应再次进行H

16、IV抗体检测。使用两种不 同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测。两种筛查 试剂的检测结果均为阴性反应，报告HIV抗体阴性，可 排除感染。检测出现阳性反应（一种为阴性反应一种 为阳性反应或两种均呈阳性反应），进一步进行确证 试验，根据确证试验的结果判断是否感染HIV。 做好检测后咨询。 HIV抗体检测结果解释 HIV抗体阴性未发生感染（排除“窗口期”） HIV抗体不确定 非特异性的反应 感染早期 感染晚期 HIV抗体阳性发生感染（排除疫苗使用） HIV抗体快速检测 HIV抗体快速检测 快速检测，是艾滋病实验室多了一种检测方法 快速检测，是为了更多更快的发现感染者 快速检测，不是为了取代实验室，但

17、不能因为有了实 验室而放弃使用快速检测 快速检测手段能否成为新型检测-咨询模式，或基于医 疗机构的有效的检测方法-取决于检测的质量 HIV抗体快速检测方法PA 明胶颗粒凝集试验（PA）：将HIV抗原致敏明胶颗粒作 为载体，与待检样品作用。当待检样品含有HIV抗体时 ，明胶颗粒与抗体发生凝集反应，根据凝集情况判读 结果。 PA试剂有两种:同时检测HIV-1和HIV-2抗体以及分别检 测HIV-1和HIV-2抗体。 有效试验必须有阴性和阳性质控。 HIV抗体快速检测方法免疫渗滤试验 免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体 硒）快速试验。 以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上，

18、加待 检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。 反应时间在10分钟以内。 有效试验的质控点必须显色。 HIV抗体快速检测方法免疫层析试验 免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固 定在膜上，待检样品（血液或唾液）沿着固相载体迁 移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。 有效试验的质控带必须显色。 结果判读严格参照试剂说明书 反应区和质控区均出现红色条带为阳性。 质控区有条带，反应区无条带为阴性。 质控区无条带则实验无效。 HIV抗体快速检测的外部质控 外部对照质控品，可采用商用质控品或自制质控品。 质控品应包含抗体阳性样品和阴性样品。自制质控品 可使用本室保留的阳性样品。不能

19、使用酶联试验的外 部质控品。 下列情况需做质量控制：更换试剂批号；更换检测人 员；更换包装；每个检测日；更换试剂厂家。 建议：每个检测日检测一次阳性和阴性质控品；如果 日检测量大于50份样品，至少应作2次质控。 快速检测的注意事项 不提倡个人在家中检测。应由经培训的专业人员操作， 注意生物安全操作，避免职业暴露发生。 在质控窗口内应出现质控带，如实验完成后未呈现质控 带，说明试剂盒内质控无效，该试验结果无效，样品须 重检。 出现以下问题，提示存在质量隐患，应引起重视：运输 包装、内盒或试剂盒的物理损伤；在单包装内存在混杂 物质；标签出现错误、缺失或字迹模糊 （特别是产品 名称或出产厂家名称，批

20、号和货号，失效期或/和生产 日期）；缺失目录；泄漏或污染；不适宜的存放条件； 保护包装纸破损或污染。 快速检测的注意事项 环境温度,尤其是在冬天 血清/血浆 全血 稀释缓冲液 样本的量 反应的时间 生物安全 废弃物处理 做好实验的原始记录 不同厂家的快检试剂操作要求 厂家厂家样品要求样品要求血量血量(ul)(ul)样品稀释样品稀释 是否加缓是否加缓 冲液冲液 最小反应最小反应 时间时间( (分钟分钟) ) 最大反应最大反应 时间时间( (分钟分钟) ) 试剂储存要试剂储存要 求求 明胶颗粒法明胶颗粒法 (PA)(PA) 血清血清/ /血浆血浆25251:321:32N N120120/ /2-102-10 DETERMINEDETERMINE 血清血清/ /血浆血浆/ / 全血全血 5050N N 用全血时用全血时 加加1 1滴滴 151560602-302-30 SDSD血清血清1010N NN N5 520201-301-30 杭州艾康杭州艾康 血清血清/ /血浆血浆/ / 全血全血 2525N N