测定蛋白酶活力试验

1、测定蛋白酶活力实验、实验目的1. 加深了解酶活力的概念。2. 学习掌握测定蛋白酶活力的方法。二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。 其大小可用在一定条件下 酶催化反应进行一定时间后， 反应体系中底物的减少量或产物的生成 量来表示。酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。 本实验规定酶活力单 位(U)为一定条件下每分钟分解1卩g酪氨酸所需的酶量。 实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。 产物酪 氨酸在碱性条件下与Foli n-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合 物在 680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化， 可计

2、算出蛋白 酶的活力。三、仪器和试剂仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。 原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g枯草杆菌蛋白酶粉，用少量 L,磷酸缓冲 液溶解并定容至100mL,震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤， 取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。试剂1. Foli n酚试剂：在2L磨口回流瓶中加入钨酸钠 （Na2WoO4 . 2H20）100g,钼酸钠 （Na2WoO4 . 2H2O）25g,蒸馏水 700mL, 85%磷酸 50mL 以及浓盐酸 100mL,充分混匀后，微火回流加热 10小时。再加入硫酸锂150g, 蒸馏水50mL和液溴数滴，摇匀后开

3、口继续煮沸15min,以驱赶过剩 的溴。冷却后加蒸馏水定容至 1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于 棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准 NaOH 溶液、酚酞为指示剂 标定酸度（约为2mol/L），然后加水稀释至1mol/L，即可使用。2. 0.2mol/L 盐酸溶液3. L 氢氧化钠溶液4. L 碳酸钠溶液5. 10%三氯乙酸溶液6. 磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠（NazHPQ . 12H2O）7.16g,用水定容至100mL（A液）； 称取磷酸二氢钠（NazHPQ .12H2O）3.12g,用水定容至100mL（B液）。取 A 液 84mL, B 液 16mL 混合后,得到磷酸缓冲液,可长期

4、存放。 临用时稀释 10 倍即可。7. 标准酪氨酸溶液（50卩g/mL）称取 以烘干至恒重的酪氨酸，用L盐 酸约 30mL 溶解后,蒸馏水定容至 250mL。8. 酪蛋白溶液）:称取1.25g酪蛋白，用L氢氧化钠溶液（20mL）溶 解,再用磷酸缓冲液定容到 250mL。四、操作步骤（一）酪氨酸标准曲线的制作取 6 支试管 （标号 0，15），按顺序分别加入，和 标准酪氨酸溶液， 再用水补足到，摇匀后各加入 L碳酸钠，摇匀。依次加入 Foli n酚 试剂，摇匀并计时，于30C水浴锅中保温15min。然后680nm处测 定吸光值（以0号管作对照）。以酪氨酸含量（卩g乍横坐标，吸光值为 纵坐标绘制标

5、准曲线。（二）酶活力测定1酶反应：取一支试管，加入的酪蛋白溶液，于30C水浴中预热5分 钟，再加入已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确保 温10min，从水浴中取出后，立即加入的10%三氯醋酸溶液，摇匀静 置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液 （样品液）。另取一试管，先加入 已 预热好的枯草杆菌蛋白酶液和 的 10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数 分钟，再加入的酪蛋白溶液，然后于30C水浴保温10min,同样干滤 纸过滤，收集滤液 （对照液）。以上两过程，应各做一次平行实验。2.滤液中酪氨酸含量的测定取3支试管，分别加入 水、A液、B液，然后各加入 mL L碳酸钠 溶液和酚试剂， 摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。 根据吸 光度值，由标准曲线查出 A、 B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶 的活力单位。五、计算酶活力单位数少刃=（乂样品7对照）KA样品一样