博士研究生课程-后基因组学的主要研究技术

1、后基因组学主要研究技术后基因组学主要研究技术 后基因组主要研究技术包括：后基因组主要研究技术包括： 生物信息学技术；生物信息学技术； 生物芯片技术；生物芯片技术； 转基因和基因敲除技术；转基因和基因敲除技术； RNA RNA 干扰技术；干扰技术； 抑制性消减杂交、基因表达谱分析、抑制性消减杂交、基因表达谱分析、RNARNA测序测序 （转录组学）；（转录组学）； 2-D2-D电泳、生物质谱技术、核磁共振、电泳、生物质谱技术、核磁共振、 PCAPCA技术技术 （蛋白质组学、糖组学、代谢组学）；（蛋白质组学、糖组学、代谢组学）； 免疫共沉淀、酵母双杂交、噬菌体展示、免疫共沉淀、酵母双杂交、噬菌体展示

2、、 SPRSPR等等 技术（相互作用组学）。技术（相互作用组学）。 一、一、生物芯片的概念生物芯片的概念 生物芯片（生物芯片（biochipbiochip）是指采用光导原位合成或）是指采用光导原位合成或 微量点样等方法，将微量点样等方法，将大量生物大分子大量生物大分子比如核酸片比如核酸片 段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品 有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰 胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维组成密集二维 分子排列分子排列，然后与已标记的待测生物样品中，然后

3、与已标记的待测生物样品中靶分靶分 子杂交子杂交，通过特定的仪器通过特定的仪器（如激光共聚焦扫描或（如激光共聚焦扫描或 电荷偶联摄影像机（电荷偶联摄影像机（CCDCCD）对杂交信号的强度进）对杂交信号的强度进 行快速、并行、高效地行快速、并行、高效地检测分析检测分析，从而判断样品，从而判断样品 中中靶分子的数量靶分子的数量。由于常用玻片。由于常用玻片/ /硅片作为固相硅片作为固相 支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技支持物，且在制备过程模拟计算机芯片的制备技 术，所以称之为生物芯片技术术，所以称之为生物芯片技术 。 生物芯片生物芯片 计算机芯片计算机芯片 二、生物芯片技术产生背景二、生物芯

4、片技术产生背景 2020世纪世纪9090年代初开始实施的年代初开始实施的人类基因组计划人类基因组计划（HGPHGP）取得）取得 了人们当初意料不到的巨大进展。目前已经测定了了人们当初意料不到的巨大进展。目前已经测定了1010多多 种微生物以及高等动植物的全基因组序列，海量的基因种微生物以及高等动植物的全基因组序列，海量的基因 序列数据正在以前所未有的速度膨胀。序列数据正在以前所未有的速度膨胀。 一个现实的科学问题摆到了人们面前：一个现实的科学问题摆到了人们面前： 如何研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能？如何研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能？ 如何有效利用如此海量的基因信息揭示人类

5、生老病死的如何有效利用如此海量的基因信息揭示人类生老病死的 一般规律，并为人类最终战胜各种病魔提供有效武器？一般规律，并为人类最终战胜各种病魔提供有效武器？ 于是，一项类似于计算机芯片技术的新兴生物高技术于是，一项类似于计算机芯片技术的新兴生物高技术 生物芯片技术生物芯片技术，随着人类基因组研究的进展应运而生了。，随着人类基因组研究的进展应运而生了。 三、生物芯片分类三、生物芯片分类 生物芯片生物芯片 DNA 芯 片 蛋白质蛋白质 芯芯 片片 芯片芯片 实实 验验 室室 基因芯片（基因芯片（Genechip)Genechip)。基因芯片是。基因芯片是最重要最重要的一种的一种 生物芯片，是指将大

6、量探针分子固定于支持物上，生物芯片，是指将大量探针分子固定于支持物上， 然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强然后与标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强 弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针弱判断靶分子的数量。用该技术可将大量的探针 同时固定于支持物上，所以一次可对大量同时固定于支持物上，所以一次可对大量核酸核酸分分 子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交子进行检测分析，从而解决了传统核酸印迹杂交 技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数技术操作复杂、自动化程度低、检测目的分子数 量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大量少、效率低等不足。它能在同一时间内分析大 量的基因，使

7、人们准确高效地破译遗传密码。量的基因，使人们准确高效地破译遗传密码。 蛋白芯片（蛋白芯片（ProteinchipProteinchip）。蛋白质芯片是）。蛋白质芯片是 可以在一个非常小的几何尺度的表面积上，可以在一个非常小的几何尺度的表面积上， 集成多种集成多种蛋白质活性分子蛋白质活性分子（配基）。仅用（配基）。仅用 微量的生物（生理）的采样即可以同时检微量的生物（生理）的采样即可以同时检 测和研究测和研究不同的分子、生物分子之间的相不同的分子、生物分子之间的相 互作用以及基因功能互作用以及基因功能的表达，获得各种条的表达，获得各种条 件下件下蛋白质组蛋白质组的条件变化，从而可以获得的条件变化

8、，从而可以获得 生命活动的规律。生命活动的规律。 芯片实验室（芯片实验室（Lab-on-a-chipLab-on-a-chip）。芯片实验）。芯片实验 室是生物芯片技术发展的最终目标。它将室是生物芯片技术发展的最终目标。它将 样品制备、生化反应以及检测分析的整个样品制备、生化反应以及检测分析的整个 过程过程集约化形成微型分析系统集约化形成微型分析系统。现在已有。现在已有 由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、 微电极、电子化学和电子发光探测器等组微电极、电子化学和电子发光探测器等组 成的芯片实验室问世，并出现了将生化反成的芯片实验室问世，并出现了将生化反 应、

9、样品制备、检测和分析等部分集成的应、样品制备、检测和分析等部分集成的 生物芯片。例如可以将样品制备和生物芯片。例如可以将样品制备和PCRPCR扩增扩增 反应同时在一块小小的芯片上完成。反应同时在一块小小的芯片上完成。 四、基因芯片制作与应用四、基因芯片制作与应用 美国美国AFFYMETRIX AFFYMETRIX公司的一些产品 公司的一些产品 19891989年的第一张芯片，年的第一张芯片， 构建在显微镜镜片上构建在显微镜镜片上 20022002年的全人类基因组芯片，年的全人类基因组芯片， 包含包含3300033000多个基因位点多个基因位点 一）基因芯片发展历史一）基因芯片发展历史 试样处理

10、 点阵固定 反应或杂交反应或杂交 芯片制作芯片制作 标记标记 洗涤洗涤 检测扫描 光刻合成光刻合成 微量点样微量点样 喷墨喷墨 纯化、标记纯化、标记 光化学检测光化学检测 电化学检测电化学检测 计算处理计算处理 二）基因芯片的特点 高度集约高度集约 大通量平行分析大通量平行分析 高灵敏度高灵敏度 样品需要量小样品需要量小 技术操作简单技术操作简单 自动化程度高自动化程度高 应用范围广应用范围广 成本相对较低成本相对较低 微板型微板型 集成电路型集成电路型 玻片玻片 型型 三）基因芯片的制备三）基因芯片的制备 固相介质：有硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、固相介质：有硅片、二氧化硅、玻璃、尼龙膜、

11、塑料等。塑料等。 靶片段：靶片段：DNADNA、寡核苷酸、寡核苷酸、RNARNA等。等。 探探 针：针：mRNAmRNA， 或是以或是以mRNAmRNA为模板合成的为模板合成的cDNAcDNA。 标记物：常采用荧光剂，如标记物：常采用荧光剂，如Cy3Cy3、Cy5Cy5，同位素、，同位素、 地高辛等。地高辛等。 示例：原位喷印合成基因芯片示例：原位喷印合成基因芯片 芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似， 不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装 的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头 可在整个芯

12、片上移动并根据芯片上不同位可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位 点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯 片上特定位置。片上特定位置。 接触式和非接触式直接点样芯片接触式和非接触式直接点样芯片 直接打印时针头与芯片接触直接打印时针头与芯片接触 喷印时针头与芯片保持一定距离喷印时针头与芯片保持一定距离 四）基因芯片的主要应用四）基因芯片的主要应用 v单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNPSNP）的鉴定）的鉴定 v基因表达分析基因表达分析 v寻找新基因寻找新基因 v大规模大规模 DNA DNA 测序测序 v疾病的诊断与治疗疾病的诊断与治疗 v个体化医疗个体化医疗 v

13、药物筛选及毒理学研究药物筛选及毒理学研究 1、单核苷酸多态性（单核苷酸多态性（SNPSNP）的鉴定）的鉴定 CheeChee等（等（ScienceScience，19961996，274274：610610613613）应用）应用 包含包含135000135000种探针（种探针（25 mer25 mer）的基因芯片，检测）的基因芯片，检测 了了16.6kb16.6kb的人类线粒体基因组中的的人类线粒体基因组中的SNPSNP位点，从位点，从 1010个样品中，检测出多达个样品中，检测出多达505505个个SNPSNP标志位点。标志位点。 Science 25 October 1996: Vol.

14、 274. no. 5287, pp. 610 - 614 Title：Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays Authors: Mark Chee, Robert Yang, Earl Hubbell, Anthony Berno, Xiaohua C. Huang, David Stern, Jim Winkler, David J. Lockhart, Macdonald S. Morris, Stephen P. A. Fodor Abstract: Rapid access to genetic infor

15、mation is central to the revolution taking place in molecular genetics. The simultaneous analysis of the entire human mitochondrial genome is described here. DNA arrays containing up to 135,000 probes complementary to the 16.6-kilobase human mitochondrial genome were generated by light- directed che

16、mical synthesis. A two-color labeling scheme was developed that allows simultaneous comparison of a polymorphic target to a reference DNA or RNA. Complete hybridization patterns were revealed in a matter of minutes. Sequence polymorphisms were detected with single-base resolution and unprecedented e

17、fficiency. The methods described are generic and can be used to address a variety of questions in molecular genetics including gene expression, genetic linkage, and genetic variability. 2、基因表达分析基因表达分析 用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地 检测出成千上万个基因的表达情况。检测出成千上万个基因的表达情况。 将成千上万个我们克隆到的将成千上万个我们克隆到

18、的特异性靶基因固定特异性靶基因固定在在 一块芯上，对来源于不同个体、不同组织、不同一块芯上，对来源于不同个体、不同组织、不同 细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同 病变、不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）病变、不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段） 下细胞内的下细胞内的mRNAmRNA或逆转录所得的或逆转录所得的cDNAcDNA进行检测，进行检测， 从而对这些基因表达的从而对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、个体特异性、组织特异性、 发育阶段特异性、分化阶段特异性发育阶段特异性、分化阶段特异性进行综合评定进行综合评定 与判断，极大加快这些基因

19、功能的确立。与判断，极大加快这些基因功能的确立。 SchenaSchena等采用拟南芥基因组内共等采用拟南芥基因组内共4545个基因个基因 的的cDNAcDNA微阵列（其中微阵列（其中1414个为完全序列，个为完全序列，3131 个为个为ESTEST），检测该植物的根、叶组织内这），检测该植物的根、叶组织内这 些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素些基因的表达水平，用不同颜色的荧光素 标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交，标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交， 经激光共聚焦显微扫描，发现该植物经激光共聚焦显微扫描，发现该植物根和根和 叶组织中存在叶组织中存在2626个基因的表达差异个基因的表达差异，

20、而参，而参 与叶绿素合成的与叶绿素合成的CAB1CAB1基因在叶组织较根组基因在叶组织较根组 织表达高织表达高500500倍。倍。 3、寻找新的基因 示例：肿瘤相关新基因的发现 4、大规模DNA测序 基因芯片利用固定探针与样品进行分子基因芯片利用固定探针与样品进行分子 杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品 的序列，这种测定方法快速而具有十分的序列，这种测定方法快速而具有十分 诱人的前景。诱人的前景。 Mark cheeMark chee等用含等用含135000135000个寡核苷酸探针个寡核苷酸探针 的阵列测定了全长为的阵列测定了全长为16.6kb16.6kb的

21、人线粒体的人线粒体 基因组序列，准确率达基因组序列，准确率达99%99%。 5 5、疾病的诊断与治疗、疾病的诊断与治疗 从正常人的基因组中分离出从正常人的基因组中分离出DNADNA与与DNADNA芯片杂交就可以得出芯片杂交就可以得出 标准图谱。从病人的基因组中分离出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNADNA与与DNADNA芯片杂交就芯片杂交就 可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以可以得出病变图谱。通过比较、分析这两种图谱，就可以 得出病变的得出病变的DNADNA信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、信息。这种基因芯片诊断技术以其快速、 高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成

22、为一项高效、敏感、经济、平行化、自动化等特点，将成为一项 现代化诊断新技术。现代化诊断新技术。 例如例如AffymetrixAffymetrix公司，把公司，把p53p53基因全长序列和已知突变的基因全长序列和已知突变的 探针集成在芯片上，制成探针集成在芯片上，制成p53p53基因芯片，将在癌症早期诊基因芯片，将在癌症早期诊 断中发挥作用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌断中发挥作用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌 耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系 列诊断芯片逐步开始进入市场。基因诊断是基因芯片中最列诊断芯片逐步开始

23、进入市场。基因诊断是基因芯片中最 具有商业化价值的应用。具有商业化价值的应用。 目前主要涉及的疾病目前主要涉及的疾病 癌症、癌症、 心血管疾病、心血管疾病、 血液病、血液病、 遗传性疾病、遗传性疾病、 神经系统疾病、神经系统疾病、 部分感染性疾病、部分感染性疾病、 免疫反应相关性疾病免疫反应相关性疾病 毒物引起的损伤等。毒物引起的损伤等。 6、个体化治疗 临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对临床上，同样药物的剂量对病人甲有效可能对 病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。病人乙不起作用，而对病人丙则可能有副作用。 在药物疗效与副作用方面，病人的反应差异很在药物疗效与副作用方面，病人的反应

24、差异很 大。这主要是由于病人遗传学上存在差异（单大。这主要是由于病人遗传学上存在差异（单 核苷酸多态性），导致对药物产生不同的反应。核苷酸多态性），导致对药物产生不同的反应。 如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再如果利用基因芯片技术对患者先进行诊断，再 开处方，就可对病人实施个体优化治疗。开处方，就可对病人实施个体优化治疗。 在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异在治疗中，很多同种疾病的具体病因是因人而异 的，用药也应因人而异。的，用药也应因人而异。 例如乙肝有较多亚型，例如乙肝有较多亚型，HBVHBV基因的多个位点如基因的多个位点如S S、 P P及及C C基因区易发生变异。若用乙肝

25、病毒基因多态基因区易发生变异。若用乙肝病毒基因多态 性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导性检测芯片每隔一段时间就检测一次，这对指导 用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。如将这些基用药防止乙肝病毒耐药性很有意义。如将这些基 因突变部位的全部序列构建为因突变部位的全部序列构建为DNADNA芯片，则可快芯片，则可快 速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生速地检测病人是这一个或那一个或多个基因发生 突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后突变，从而可对症下药，所以对指导治疗和预后 有很大的意义。有很大的意义。 7 7、药物筛选及毒理学研究、药物筛选及毒理学研究 在基因功能研究基础上，特别是确立

26、了与在基因功能研究基础上，特别是确立了与 某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针 对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基 因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和 正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变 化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通 量筛选（量筛选（high throughout screeninghigh throughout screening），可），可 使新药开发获得技术

27、上的突破。使新药开发获得技术上的突破。 七）基因芯片的发展方向七）基因芯片的发展方向 减小实验误差，提高精确度，降低成本减小实验误差，提高精确度，降低成本 基因芯片技术的工业化基因芯片技术的工业化 基因芯片的数据处理基因芯片的数据处理 基因芯片和组织芯片、细胞芯片等其他类基因芯片和组织芯片、细胞芯片等其他类 型芯片的有机结合型芯片的有机结合 八）应用前景及市场展望 前景：前景：生物芯片的成熟和应用一方面将为本生物芯片的成熟和应用一方面将为本 世纪的世纪的疾病诊断和治疗、新药开发、分子生疾病诊断和治疗、新药开发、分子生 物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环物学、航空航天、司法鉴定、食品卫生和环

28、 境监测境监测等领域带来一场革命；另一方面生物等领域带来一场革命；另一方面生物 芯片的出现为人类提供了能够对个体生物信芯片的出现为人类提供了能够对个体生物信 息进行高速、并行采集和分析的强有力的技息进行高速、并行采集和分析的强有力的技 术手段，故必将成为未来生物信息学研究中术手段，故必将成为未来生物信息学研究中 的一个重要信息采集和处理平台。的一个重要信息采集和处理平台。 市场展望市场展望 关于生物芯片的市场状况，到关于生物芯片的市场状况，到20012001年，全世界生物芯片年，全世界生物芯片 的市场已达的市场已达170170亿美元，用生物芯片进行药理遗传学和药亿美元，用生物芯片进行药理遗传学

29、和药 理基因组学研究所涉及的世界药物市场每年约理基因组学研究所涉及的世界药物市场每年约18001800亿美亿美 元。在最近的元。在最近的5 5年之内，应用生物芯片的市场销售将达到年之内，应用生物芯片的市场销售将达到 200200亿美元左右。亿美元左右。 根据专家统计：全球目前生物芯片工业产值最近根据专家统计：全球目前生物芯片工业产值最近5 5年的市年的市 场销售可达到场销售可达到200200亿美元以上。到亿美元以上。到 20102010年，仅美国用于年，仅美国用于 基因组研究的芯片销售额将达基因组研究的芯片销售额将达400400亿美元。这还不包括用亿美元。这还不包括用 于疾病预防及诊治及其它领

30、域中的基因芯片，这部分预于疾病预防及诊治及其它领域中的基因芯片，这部分预 计比基因组研究用量还要大上百倍。因此，基因芯片及计比基因组研究用量还要大上百倍。因此，基因芯片及 相关产品产业将取代微电子芯片产业，成为本世纪最大相关产品产业将取代微电子芯片产业，成为本世纪最大 的产业。的产业。 一、转基因技术 (Transgenic technology) 19821982年，英国的年，英国的自然自然杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转 基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中, ,培育出具

31、快速生培育出具快速生 长效应的长效应的“转基因超级鼠转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快 2 23 3倍，体积大一倍。倍，体积大一倍。 转基因技术是指将人工分离和修饰过的基转基因技术是指将人工分离和修饰过的基 因或因或DNADNA导入到生物体的细胞基因组中，引导入到生物体的细胞基因组中，引 起生物体性状稳定地整合、表达和遗传的起生物体性状稳定地整合、表达和遗传的 技术技术. . 依据转移的对象不同可分为动物转基因技依据转移的对象不同可分为动物转基因技 术和植物转基因技术。术和植物转基因技术。 一）定义一）定义 二）动物转基因技术二）动物

32、转基因技术 原核显微注射法原核显微注射法 逆转录病毒载体法逆转录病毒载体法 胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法 精子介导法精子介导法 1 1、原核显微注射法原核显微注射法 原核显微注射法又称原核显微注射法又称DNADNA显微注射法，即通过显显微注射法，即通过显 微操作仪将外源基因直接用注射器注入微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵受精卵， 利用外源基因整合到利用外源基因整合到DNADNA中，发育成转基因动物。中，发育成转基因动物。 优点：外源基因的导入整合效率较高，不需要载优点：外源基因的导入整合效率较高，不需要载 体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达体，直接转移目的基因，目的基因的长度

33、可达 100kb100kb。它可以直接获得纯系，所以实验周期短。它可以直接获得纯系，所以实验周期短. . 缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且 外源基因的整合位点和整合的拷贝数外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，都无法控制， 易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的 性状改变，重则致死。性状改变，重则致死。 牙本质涎蛋白转基因小鼠的构建牙本质涎蛋白转基因小鼠的构建( (孙汗堂等，孙汗堂等，20062006） 目的目的: :构建小鼠牙本质涎蛋白构建小鼠牙本质涎蛋白(DSP)(DSP)转基因小鼠。转

34、基因小鼠。 方法方法: :将将pcDNA3.1pcDNA3.1载体中的载体中的CMVCMV启动子替换为启动子启动子替换为启动子c-actin,c-actin, 构建载体构建载体pcDNA3.1-CX,pcDNA3.1-CX,然后将然后将PCRPCR获得的获得的DSPDSP基因编码序列克隆基因编码序列克隆 到到pcDNA3.1-CXpcDNA3.1-CX中中, ,构建构建DSPDSP转基因载体转基因载体pcDNA3.1-CX-dsp;pcDNA3.1-CX-dsp;将线性将线性 化的载体化的载体DNADNA注射注射到小鼠受精卵的雄到小鼠受精卵的雄原核原核, ,受精卵移植到假孕母受精卵移植到假孕母

35、 鼠的输卵管。仔鼠出生后鼠的输卵管。仔鼠出生后, ,用用PCRPCR及及Southern blotSouthern blot检测阳性小鼠。检测阳性小鼠。 结果共移植结果共移植717717枚枚注射注射过的受精卵至过的受精卵至2929只受体鼠只受体鼠, ,移卵后产仔移卵后产仔6767 只只, ,阳性阳性4 4只。阳性鼠分别传代只。阳性鼠分别传代, ,开始建系。结论通过开始建系。结论通过显微注射显微注射的的 方法成功获得了方法成功获得了DSPDSP转基因小鼠。转基因小鼠。 2、逆转录病毒载体法、逆转录病毒载体法 逆转录病毒载体法将目的基因重组到逆转录病毒载体法将目的基因重组到逆转录逆转录病毒病毒 载

36、体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床 前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放 逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的 目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主 基因组基因组DNADNA中去。中去。 优点：无需要重排，可在整合点整合转移基因的优点：无需要重排，可在整合点整合转移基因的 单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者 与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘与被感

37、染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘 里，整合有逆转录病毒的里，整合有逆转录病毒的DNA DNA 的胚胎率的胚胎率高高。 缺点：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入缺点：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入 逆转录病毒的基因有一定的大小限度；转基因的逆转录病毒的基因有一定的大小限度；转基因的 表达问题尚未解决。表达问题尚未解决。 逆转录病毒介导法制备转基因鸡的基本过程逆转录病毒介导法制备转基因鸡的基本过程 Nature Biotechnology 20, 396 - 399 (2002) Expression of exogenous protein in the egg white of t

38、ransgenic chickens Alex J. Harvey, Gordon Speksnijder, Larry R. Baugh, Julie A. Morris ;二是器官移植的免疫排斥反应。目前要找到与受体血二是器官移植的免疫排斥反应。目前要找到与受体血 清型完全相匹配的器官可能性很小清型完全相匹配的器官可能性很小, ,临床上只能靠药物来抑止临床上只能靠药物来抑止 排斥反应。基因敲除动物模型可能会解决这两个难题。排斥反应。基因敲除动物模型可能会解决这两个难题。 Kuwaki Kuwaki 等采用基因敲除法等采用基因敲除法, ,将引起超急性排斥反应的半乳糖将引起超急性排斥反应的半乳

39、糖 转移酶基因敲除转移酶基因敲除, ,用此方法培育的动物的器官可以移植到人体用此方法培育的动物的器官可以移植到人体 而无排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基因敲除猪而无排斥反应。他们已成功培育半乳糖转移酶基因敲除猪, ,且且 已经开展了将该基因敲除猪的心脏移植至狒狒体内的实验已经开展了将该基因敲除猪的心脏移植至狒狒体内的实验, ,经经 移植后的狒狒存活了移植后的狒狒存活了2 - 6 2 - 6 个月个月( (均值为均值为7878天天) ,) ,且均未出现且均未出现 超急性排斥反应的表现。这是目前为止异种心脏移植存活时超急性排斥反应的表现。这是目前为止异种心脏移植存活时 间最长的例子。虽然异种

40、心脏移植还有许多问题需要解决间最长的例子。虽然异种心脏移植还有许多问题需要解决, ,但但 使人类看到了希望。使人类看到了希望。 3在动物育种中的应用在动物育种中的应用 通过基因打靶可以定点地引入优良通过基因打靶可以定点地引入优良 基因基因, ,提高外源基因的稳定性和表达效率提高外源基因的稳定性和表达效率, , 从而改变动物的遗传特性从而改变动物的遗传特性, ,提高动物的生提高动物的生 产性能产性能, ,增强其抗病力增强其抗病力, ,最终育成满足人最终育成满足人 们需要的高产、优质、抗病新品种。们需要的高产、优质、抗病新品种。 基因敲除在猪育种中的应用 用基因打靶的方式对猪的基因进行修饰和用基因

41、打靶的方式对猪的基因进行修饰和 改造改造, ,可产生一些人类需要的新品种如动物可产生一些人类需要的新品种如动物 的的myostatin(MSTN)myostatin(MSTN)基因基因, ,对肌纤维的形成对肌纤维的形成 具有负调控作用具有负调控作用, ,实验证明实验证明, ,双肌牛即是由双肌牛即是由 于于MSTNMSTN基因外显子基因外显子3 3的个别碱基突变造成的的个别碱基突变造成的, , 若能在猪上敲除若能在猪上敲除MSTNMSTN基因基因, ,将可产生骨骼肌将可产生骨骼肌 明显增大的双肌品种明显增大的双肌品种, ,提高生产性能。提高生产性能。 六、基因敲除存在的问题 基因敲除技术允许科学

42、家极为精确的操作单个基因基因敲除技术允许科学家极为精确的操作单个基因, ,遗遗 传改变非常清楚传改变非常清楚, ,可以研究以前经典遗传无法了解的基可以研究以前经典遗传无法了解的基 因表现型效应。基因敲除动物的出现使各个科学领域因表现型效应。基因敲除动物的出现使各个科学领域 的研究深入到了过去无法到达的深度。的研究深入到了过去无法到达的深度。 但这一技术也存在一些问题但这一技术也存在一些问题, ,近年来近年来, ,人们争论的焦点人们争论的焦点 是是: :基因敲除动物模型的表型是否是由突变的靶基因造基因敲除动物模型的表型是否是由突变的靶基因造 成的。成的。Gerlai Gerlai 等指出等指出,

43、 ,目前基因敲除的结果忽略了目前基因敲除的结果忽略了背背 景基因景基因的作用的作用, ,由于敲除基因的缺失由于敲除基因的缺失, ,动物机体可能产动物机体可能产 生一种雪崩式的代偿过程生一种雪崩式的代偿过程, ,引起基因的第二次改变引起基因的第二次改变, ,因因 此有理由相信一个复杂的表型改变与某一特定的基因此有理由相信一个复杂的表型改变与某一特定的基因 不是完全一对一的因果关系。不是完全一对一的因果关系。Nagy Nagy 也指出除遗传背景也指出除遗传背景 外外, ,还有其他许多因素使基因敲除结果复杂化还有其他许多因素使基因敲除结果复杂化, ,由于基由于基 因突变体在体内所有组织发育的过程都会

44、丢失因突变体在体内所有组织发育的过程都会丢失, ,因此，因此， 不能排除其他器官缺陷参与表型改变的可能性。不能排除其他器官缺陷参与表型改变的可能性。 七、展望 随着基因敲除动物的应用和发展随着基因敲除动物的应用和发展, ,今后将主要围绕下列问题进行研究今后将主要围绕下列问题进行研究: : 进一步发展可诱导型的组织特异性基因敲除动物。进一步发展可诱导型的组织特异性基因敲除动物。 争取在时间、范围、程度等方面对基因敲除进行调控争取在时间、范围、程度等方面对基因敲除进行调控, ,对系统内的多对系统内的多 个基因进行深入的研究。个基因进行深入的研究。 选择不同的靶基因选择不同的靶基因, ,从疾病模型的

45、建立到基因治疗从疾病模型的建立到基因治疗, ,从药物生产到改良从药物生产到改良 动植物的品种等方面进行实践。动植物的品种等方面进行实践。 对于如何消除背景的混淆效应对于如何消除背景的混淆效应, ,一个经典的方法是回交降低背景基因一个经典的方法是回交降低背景基因 发挥作用的可能性发挥作用的可能性; ;另一种方法是导入一个外源基因或直接导入蛋白另一种方法是导入一个外源基因或直接导入蛋白, ,恢恢 复丢失的功能复丢失的功能, ,如果突变动物表型转为正常如果突变动物表型转为正常, ,说明表型的改变与基因敲除说明表型的改变与基因敲除 有关。有关。 目前目前, ,绝大部分基因敲除动物来源于小鼠绝大部分基因

46、敲除动物来源于小鼠, ,而据统计这些基因敲除小鼠被而据统计这些基因敲除小鼠被 敲出的基因仅占小鼠基因组的敲出的基因仅占小鼠基因组的10 %10 %。最近。最近, ,美国一机构正倡导各地科学美国一机构正倡导各地科学 家共同建立一个覆盖小鼠全基因组的基因敲除小鼠资源库。这一资源库家共同建立一个覆盖小鼠全基因组的基因敲除小鼠资源库。这一资源库 的建立必将极大地推动生物医学研究的发展。人类全基因组序列分析已的建立必将极大地推动生物医学研究的发展。人类全基因组序列分析已 完成完成, ,功能基因组学研究正在大规模地开展功能基因组学研究正在大规模地开展, ,基因打靶已成为后基因组时基因打靶已成为后基因组时

47、代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。 总总 之之 随着现代分子生物学的发展和人类基因组随着现代分子生物学的发展和人类基因组 图谱的完成图谱的完成, ,功能基因组学研究正大规模启动功能基因组学研究正大规模启动, , 基因打靶已成为后基因组时代研究基因打靶已成为后基因组时代研究基因功能基因功能最最 直接和最有效的方法之一。直接和最有效的方法之一。 基于基因打靶途径建立的医学病理生物模基于基因打靶途径建立的医学病理生物模 型在人类遗传性疾病的基因治疗中发挥着不可型在人类遗传性疾病的基因治疗中发挥着不可 估量的巨大作用。基因打靶技术将对哺乳动物估量的巨大作用

48、。基因打靶技术将对哺乳动物 发育生物学、免疫学、肿瘤神经生物学和医学发育生物学、免疫学、肿瘤神经生物学和医学 遗传育种等学科产生深远的影响。遗传育种等学科产生深远的影响。 第三部分 RNA干扰技术 一、一、RNARNA干扰机制奠基人摘得干扰机制奠基人摘得20062006 年诺贝尔生理奖年诺贝尔生理奖 据新华社电据新华社电 瑞典卡罗林斯卡医学院瑞典卡罗林斯卡医学院1010月月2 2日宣布，将日宣布，将 20062006年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家年度诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家Andrew Andrew FireFire（安德鲁（安德鲁菲尔）和菲尔）和Craig MelloCra

49、ig Mello（克雷格（克雷格梅洛），梅洛）， 以表彰他们发现了以表彰他们发现了RNA(RNA(核糖核酸核糖核酸) )干扰机制。干扰机制。 诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，诺贝尔奖评审委员会发布的公报说，Andrew FireAndrew Fire和和 Craig MelloCraig Mello获奖是因为他们获奖是因为他们“发现了控制遗传信息流动发现了控制遗传信息流动 的基本机制的基本机制”。公报指出，。公报指出，RNARNA干扰已被广泛用作研究基干扰已被广泛用作研究基 因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治因功能的一种手段，并有望在未来帮助科学家开发出治 疗疾病的新疗法。疗疾病

50、的新疗法。 Craig MelloCraig Mello出生于出生于19601960年，美国公民，年，美国公民， 19901990年获得哈佛大学生物学博士学位，现年获得哈佛大学生物学博士学位，现 任马萨诸塞州医学院分子医学教授。任马萨诸塞州医学院分子医学教授。 Andrew FireAndrew Fire出生于出生于19591959年，美国公民，年，美国公民， 19831983年获美国麻省理工学院生物学博士学位，年获美国麻省理工学院生物学博士学位， 现任斯坦福医学院病理学和遗传学教授。现任斯坦福医学院病理学和遗传学教授。 Their Paper Potent and specific gene

51、tic interference by double-stranded RNA in Caenorhabdi -tis elegans. A Fire, S Xu, MK Montgomery, SA Kostas, SE Driver, and CC Mello Nature, February 19, 1998; 391(6669): 806-11. Abstract Experimental introduction of RNA into cells can be used in certain biological systems to interfere with the func

52、tion of an endogenous gene. Such effects have been proposed to result from a simple antisense mechanism that depends on hybridization between the injected RNA and endogenous messenger RNA transcripts. RNA interference has been used in the nematode Caenorhabditis elegans to manipulate gene expression

53、. Here we investigate the requirements for structure and delivery of the interfering RNA. To our surprise, we found that double- stranded RNA was substantially more effective at producing interference than was either strand individually. After injection into adult animals, purified single strands ha

54、d at most a modest effect, whereas double-stranded mixtures caused potent and specific interference. The effects of this interference were evident in both the injected animals and their progeny. Only a few molecules of injected double-stranded RNA were required per affected cell, arguing against sto

55、chiometric interference with endogenous mRNA and suggesting that there could be a catalytic or amplification component in the interference process. 二、什么是RNA干扰 RNARNA干扰（干扰（RNA interferenceRNA interference，RNAiRNAi）：外）：外 源和内源性双链源和内源性双链RNARNA（double-stranded RNAdouble-stranded RNA， dsRNAdsRNA）在细胞内诱导同源序

56、列的）在细胞内诱导同源序列的基因表达基因表达 受抑受抑的现象的现象 三、RNAi的发现 RNAi RNAi 是是Napoli C D Napoli C D 等在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因等在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因, , 用以增加其花色时发现的。结果出乎预料用以增加其花色时发现的。结果出乎预料, ,转基因的植株不仅没转基因的植株不仅没 有新基因的表达有新基因的表达, ,反而自身的色素合成也减弱了反而自身的色素合成也减弱了, ,一些转基因的花一些转基因的花 出现了全白色或部分白色。他们把这种导入的基因未表达和植物出现了全白色或部分白色。他们把这种导入的基因未表达和植物 本身合成

57、色素基因的失活现象命名为共抑制本身合成色素基因的失活现象命名为共抑制(co suppression) (co suppression) 。 之后之后,Ramano ,Ramano 等在向粗糙孢菌等在向粗糙孢菌( Neuros pora crassa) ( Neuros pora crassa) 中导入合中导入合 成胡萝卜素的基因时造成失活成胡萝卜素的基因时造成失活, , 他们称为基因静止他们称为基因静止( quelling) ( quelling) 。 Guo S Guo S 等发现正义等发现正义RNA RNA 与反义与反义RNA RNA 有相同水平的抑制效应有相同水平的抑制效应, ,但未但未

58、 能就此现象给出合理的解释。能就此现象给出合理的解释。 Fire A Fire A 等在研究反义核苷酸时发现在线虫体内等在研究反义核苷酸时发现在线虫体内, ,双链双链RNA RNA ( double st randed RNA ,dsRNA) ( double st randed RNA ,dsRNA) 能有效地抑制有互补序列的能有效地抑制有互补序列的 内源性基因内源性基因, ,且抑制效果优于单链反义且抑制效果优于单链反义RNA RNA 。 至此至此, ,正式提出了双链正式提出了双链RNA RNA 诱导诱导 RNAi RNAi 的概念的概念, ,开启了开启了RNAi RNAi 研究研究 的序幕

59、。的序幕。 四、RNAi可能的反应机制 虽然虽然RNAi RNAi 作用的确切机制尚不清楚作用的确切机制尚不清楚, ,但目前普但目前普 遍认可是遍认可是Bass Bass 假说。具体概括为三个阶段：假说。具体概括为三个阶段： 起始阶段：起始阶段：siRNAsiRNA(small interfering RNA , (small interfering RNA , siRNA)siRNA)的形成的形成 引发阶段：引发阶段：RISCRISC（RNA induced silencing RNA induced silencing complex)complex)的形成和效应阶段的形成和效应阶段 循环

60、放大阶段：即循环放大阶段：即RdRPRdRP（RNA-depended RNA RNA-depended RNA Polymerase)Polymerase)的扩增阶段的扩增阶段 1、起始阶段 在细胞内在细胞内, ,双链双链RNA ( dsRNA)RNA ( dsRNA)由核酸酶由核酸酶(RNase ) (RNase ) Dicer Dicer 在在ATP ATP 的参与下被处理为的参与下被处理为21 21 个个23 23 个碱基的个碱基的 小小RNA ,RNA ,即小干扰即小干扰RNA( small interfering RNA , RNA( small interfering RNA ,