微生物限度检查操作规程

1、西安利君精华药业有限责任公司GMP管理文件题 目微生物限度检查操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 1 页制 定审 核批 准制定日期审核日期批准日期颁发部门公司办颁发数量 4生效日期分发单位化验室、质检办、质量管理部、质量副总1.目的：建立微生物限度检查操作规程，保证检验检验结果的准确性。2.范围：用于本公司非规定灭菌制剂及原辅料内包材受到微生物污染程度的检查，包括染菌量及控制菌的检查。3.责任：质检员执行，质检办主任检查，质量管理部经理监督。4.执行标准：中国药典2005年版二部附录XIJ 盐酸丁卡因胶浆 及原辅料内包材细菌数10个/克或ml霉菌及酵母菌数不得检出/克或ml

2、铜绿假单胞菌不得检出/克或ml金黄色葡萄球菌不得检出/克或ml大肠埃希菌不得检出/克或ml鱼腥草素钠栓及原辅料内包材细菌数100个/克或ml霉菌及酵母菌数10个/克或ml铜绿假单胞菌不得检出/克或ml金黄色葡萄球菌不得检出/克或ml红霉素栓及原辅料内包材细菌数1000个/克或ml霉菌及酵母菌数100个/克或ml铜绿假单胞菌不得检出/克或ml金黄色葡萄球菌不得检出/克或ml大肠埃希菌不得检出/克或ml固体制剂及原辅料内包材原料药细菌数1000个/克或100个/ML霉菌及酵母菌数100个/克大肠埃希菌不得检出/克题 目微生物限度检查操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 2 页5.

3、设备、仪器及用具:5.1.无菌室：净化工作台、天平、乙醇棉、乙醇灯、火柴、大小橡皮乳头等。5.2. 恒温培养箱（3035）、生化培养箱（2528）、微波炉、康氏振荡器、匀浆仪（30008000rmin）、恒温水浴、电热干燥箱（250300）、电冰箱、高压蒸汽灭菌锅，菌落计数器、显微镜、366nm紫外灯、天平、PH系列比色计。5.3.玻璃器皿：锥形瓶（250300ml）、研钵、培养皿、量筒（100ml）、试管、吸管（1ml、10ml）注射器、注射针头、载玻片、盖玻片、带盖玻璃消毒缸（玻璃器皿用前洗涤干净再用牛皮纸包扎好，121高压灭菌30分钟，烘干备用）离心机（5004000/min）、薄膜过滤

4、装置、微孔滤膜直径约50mm孔径0.450.02um。5.4.大小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并定期用75乙醇溶液浸泡。5.5.无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套用牛皮纸包严灭菌）。5.6.接种环、乙醇灯、乙醇棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、灭菌锥、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓷盖、灭菌称样纸，实验记录纸等。6.试液及培养基：6.1. 消毒液：0.2苯扎溴铵溶液（供洗手，擦拭操作台面 用）; 5石碳酸溶液 75乙醇溶液题 目微生物限度检查操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 3 页6.2.稀释剂和试剂6.2.1. 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液(PH7.0)；取

5、磷酸二氢钾3.56g，磷酸氢二钠7.23g，氯化钠4.30g蛋白胨1.0g，加水使溶解成1000ml分装，121高压灭菌。6.2.2无菌磷酸盐缓冲液（PH7.6）：取磷酸二氢钾27.22g,加水使溶解成1000ml,取50ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液42.4ml,再加水稀释成200ml分装，121高压灭菌。6.2.3无菌磷酸盐缓冲液（PH7.8）：甲液：取磷酸二氢钠35.9g,加水使溶解成500ml；乙液：取磷酸二氢钠2.76g,加水使溶解成100ml；取上述甲液91.5ml与乙液8.5ml混合，摇匀分装，121高压灭菌。6.2.4 0.9%无菌氯化钠溶液：取氯化钠9g，加水使溶解成1

6、000ml分装,121高压灭菌。6.2.5无菌对氨基苯甲酸溶液：取对氨基苯甲酸0.1g加入含10ml水的带塞试管中，121高压灭菌。6.2.6无菌聚山梨酯80氯化钠溶液：取聚山梨酯80ml 加0.9氯化钠溶液使成100ml，121高压灭菌。6.2.7欧波试液(靛基质试液）：取对二甲氨基苯甲醛1.0g加入95乙醇95ml,充分振摇，使完全溶解后，取浓盐酸20ml徐徐滴入，边加边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深，置冰箱保存，备用。6.2.8甲基红试液：取甲基红0.1g，95乙醇300ml，蒸馏水适量，使溶解后加水至500ml。题 目 微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R0

7、1第 4 页6.2.9氢氧化钾试液：取氢氧化钾试液40.0g加水使成100ml。6.2.10.萘酚乙醇试液：取萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解100ml。6.2.11沙黄染液：取沙黄0.25g，加95的乙醇10ml，使完全溶解后，加水至100ml.6.2.12结晶紫染液：取结晶紫1.0g，加95的乙醇20ml。使溶解。加1草酸铵溶液80ml混匀，静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存。6.2.13碘试液:取碘化钾2.0g，加水35ml使溶解，加入碘片1.0g使全部溶解后，加水稀释至300ml，置密闭棕色瓶中储存。6.2.14中性红指示液：取中性红1.0g，研细，加95乙醇60ml，使溶解，再加水至

8、100ml。变色范围PH6.08.0（红黄）。6.2.15亚甲蓝指示液：取亚甲蓝0.5g，加水使溶解成100ml。6.2.16溴麝香草酚蓝指示液：取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml 使溶解，再加水100ml,变色范围PH6.07.6（黄蓝）。6.2.17酸性品红指示液：取酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水 内保持15分钟再静置2小时，滤过，即得。优点：无色，在倒管内早期发酵易观察，不易被还原。题 目微生物限度检查法操作规程共29 页文件编码JHCZZL11

9、4R01第 5页6.2.18曙红钠指示液：取曙红钠2.0g。加水使溶解成100ml。6.2.19磷酸盐缓冲液：PH7.2取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1ml，用水稀释至100ml，121高压灭菌，即得。6.2.20 1盐酸二甲基对苯二胺试液：取二盐酸二甲基对苯二胺01g，加水10ml，即得。6.2.21盐酸试液：取盐酸8.4ml，加水使稀释成100ml。6.2.22无菌枸橼酸钠氯化钠溶液 取枸橼酸钠0.5g，加0.9%氯化钠溶液10ml，121高压灭菌。6.2.23 1酚磺酞指示液 取酚磺酞1.0g，加1mol/L氢氧化钠溶液2.82ml，使溶解，再加水至100m

10、l。6.3.培养基：6.3.1.营养琼脂培养基：称营养琼脂培养基32g，加1000ml蒸馏水加热溶解（调节PH值为7.2）121高压灭菌。6.3.2虎红琼脂培养基，称取虎红琼脂培养基30.5g，加水1L加热溶解分装，121高压灭菌。6.3.34甲基伞形酮葡萄糖苷酸蛋白胨培养基：取4甲基伞形酮葡萄糖苷酸蛋白胨培养基粉23.3g，加1L蒸馏水加热溶解,分装,121高压灭菌。6.3.4 5乳糖培养基：胨0.2g 、溴麝香草酚蓝指示液 0.6ml氯化钠0.3g 、乳糖 5g、磷酸氢二钠0.2g 、水 100ml6.3.5蛋白胨水培养基：胰蛋白胨10g 、水 1000ml、氯化钠5g题 目微生物限度检查

11、法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 6页6.3.6磷酸盐葡萄糖胨水培养基： 胨 7g 、磷酸氢二钾 3.8g、 萄萄糖 5g 、 水1000ml, 取上述成分混合微温使溶解，调节PH 值为7.30.1，分装于小试管，灭菌。6.3.7 构橼酸盐培养基：氯化钠5g 、构橼酸钠（无水) 2g 、硫酸镁 0.2g 、0.4%溴麝香草酚蓝指示液 20ml、磷酸氢二钾 1g、琼脂 1520g、磷酸二氢铵1g 、水 1000ml,除指示液和琼脂外,取上述成分混合,微温使溶解,调节PH值为6.90.1,加入琼脂,加热溶化,加入指示液,摇匀,分装于小试管,灭菌,置成斜面。6.3.8曙红亚甲

12、蓝（EMB）琼脂培养基：取曙红亚甲蓝琼脂培养基粉42g，加1L蒸馏水, 加热溶解,分装,121高压灭菌。6.3.9溴代十六烷基三甲基培养基： 胨10g 、溴代十六烷基三甲胺0.3g牛肉浸出粉3g 、琼脂 1520g、氯化钠 5g水 1000ml,除琼脂外，取上述成分混合，微温使溶解，调节PH值使灭菌后为7.5加入琼脂，加热溶化后，分装，灭菌。6.3.10绿脓素测定用培养基（PDP琼脂）：胨20g 、甘油10ml、氯化镁（无水）1.4g、琼脂 1520g、硫酸钾（无水）10g、水1000ml,取胨，氯化镁和硫酸钾加入水中，微温使溶解，调节PH值使灭菌后为7.3，加入甘油及琼脂，加热溶化，混匀，分

13、装于试管，灭菌。 6.3.11硝酸盐胨水培养基：胨10g、 硝酸钾 2g、酵母浸出粉3g、 亚题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 7页 硝酸钠 0.5g、水1000ml,取胨和酵母浸出粉加水中，微温使溶解，调节PH值使灭菌后为7.3加入硝酸钾和亚硝酸钠溶解，混匀，灭菌。6.3.12亚碲酸盐肉汤培养基 临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1亚酸钠（钾）试液0.2ml混匀，即得。6.3.13卵黄氯化钠琼脂培养基：胨 6g、 氯化钠 30g、 琼脂14g 、牛肉浸出粉 1.8g 、10氯化钠卵黄液100ml 、水 650ml ,除10氯

14、化钠卵黄液外，充分混匀，勿振摇，倾注平皿。10氯化钠卵黄液的制备，取新鲜鸡蛋一个，以无菌操作取出卵黄，放入10无菌氯化钠溶液100ml中，充分混匀。6.3.14甘露醇氯化钠琼脂培养基:胨 10g、 氯化钠75g 、 水1000ml、牛肉浸出粉1g 、酚磺酞指示液 2.5ml、甘露醇10g 、 琼脂 1520g,除甘露醇、指示液及琼脂外，取上述成分，微温使溶解，调节PH值使灭菌后为7.40.2加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌。6.3.15胆盐乳糖发酵培养基:蛋白胨20g0.04%溴甲酚紫25ml乳糖10g水1000ml脱氧胆酸钠0.25g除指示剂外，取上述成分加至水中，微温溶解，调PH值至

15、灭菌后7.2-b加入指示剂，分装管中，每管10ml，加一倒管。115灭菌30min。6.3.16乳糖发酵培养基蛋白胨20g、0.04%溴甲酚紫25ml、乳糖10g、水1000ml，题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 8页除指示剂外，取上述成分加至水中，微温溶解，调PH值使灭菌后7.2-7.5加入指示剂，分装小管，每管3ml，加一倒管，115灭菌30min.6.3.17曙红亚甲蓝（EMB）琼脂营养琼脂培养基100ml曙红钠指示液2ml2%乳糖溶液5ml亚甲蓝指示液1.3-1.6ml取营养琼脂培养基，加热溶化后，冷至60按无菌操作加入灭菌的其它三种溶液摇匀

16、，倾注平皿。6.3.18麦康凯琼脂培养基（MacC）胨20g1%中性红指示液3ml乳糖10g琼脂14g牛胆盐5g氯化钠5g水1000ml除乳糖、指示液、牛胆盐及琼脂外，取上述成分混合，加热溶解，调节PH使灭菌后为7.20.2，加入琼脂，加热溶化后，再加入基各成分、摇匀、分装、灭菌、冷至60倾注平皿。6.3.19营养肉汤培养基：取营养肉汤培养基粉1.8g，加1000ml蒸馏水加热溶解,分装121高压灭菌。6.3.20胆盐乳糖（BL）培养基：取胆盐乳糖培养基粉36g，加1L蒸馏水加热溶解,分装,121高压灭菌。6.3.21培养基配备时应注意：采用干燥培养基，按说明配制，应对灭菌后的培养基PH值进行

17、校验；题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第9页配制的培养基不应有沉淀;培养基的分装不得超过容器的23，以免 灭菌时溢出;培养基配制后应在2小时内灭菌，避免细菌繁殖;灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长。7.供试品抽样、保存及检验量:7.1 抽样7.1.1一般采用随机抽样方法，抽样量应为检验用量（2个以上 最小包装单位）的3倍量（以备复试）。7.1.2抽样时，凡发现有异常或可疑的样品，应透取有疑问的样品，但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。7.1.3凡能从药品瓶口外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品可直接判为不合格品，无需再抽样检验。7.2

18、 保存7.2.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因，保存条件不妥引起致死，损伤式繁殖。7.2.2供试品在检验之前应保持原包装状态，严禁开启包装，已开启的样品不得作为供试品。7.3 检验量：即一次试验所用的供试品量（g、ml或）。一般应随机抽取不少于检验用量3倍量的供试品。7.3.1所有剂型的检验量均需取2个以上包装单位。 7.3.2固体及半固体制剂检验量为10g； 液体制剂为10ml；化学膜剂为100。题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 10 页7.4试验前准备7.4.1将所有已灭菌的平皿、锥形瓶、吸管（1ml、

19、10ml）、试管、量筒、稀释液及供试品等移置无菌室内，开紫外灯灭菌30min。7.4.2操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1苯扎溴 溶液或其它消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供试品的瓶、盒、袋等的开口周围处。3 操作方法：8.1细菌、霉菌及酵母菌的检查：8.1.1采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，8.1.1采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。各品种供试液的制备及检验方法详见下表：题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R

20、01第 11页供试品供试液的制备细菌数的检验方法霉菌酵母菌数的检验方法益肝灵胶囊称取供试品10g，加PH7.0无菌NaCl蛋白胨缓冲液100ml，制成1：10的供试液。 取1：10供试液的上清液0.5ml/皿置直径90mm的无菌皿中培养取1：10供试液1ml/皿置直径90mm的无菌平皿中培养甲芬那酸片甲芬那酸胶囊取1：100供试液1ml/皿置直径90mm的无菌平皿中培养吲哚美辛胶囊取1：10供试液0.2ml/皿置直径90mm的无菌平皿中培养联磺甲氧苄啶胶囊称取供试品10g,加PH7.0无菌NaCl蛋白胨缓冲液95ml，和1%对氨基苯甲酸5ml，做为1：10的供试液取1：10供试液的上清液1ml

21、/膜加入薄膜过滤器中，用800ml/膜的PH7.0无菌NaCl蛋白胨缓冲液冲洗，冲洗后取出滤膜面朝上贴于营养琼脂培养基平板上培养复方磺胺甲噁唑胶囊称取供试品10g,加PH7.0无菌NaCl蛋白胨缓冲液92ml，和1%对氨基苯甲酸8ml，混匀作为1：10的供试液盐酸丁卡因胶浆供取试品10ml，加无菌聚山梨酯805ml，加PH7.0无菌NaCl蛋白胨缓冲液85ml至45水浴中10分钟使溶混匀，作为1：10的供试液取1：10供试液1ml/膜加入薄膜过滤器中，用0.1%蛋白胨水溶液500ml冲洗，冲洗后取出滤膜面朝上贴于营养琼脂培养基平板上培养维生素C片称取供试品10g，加PH7.0无菌NaCl蛋白胨

22、缓冲液100ml制成1：10的供试液取1：10供试液上清液1ml/膜加入到含有30ml0.1%的蛋白胨水溶液的薄膜过滤器中，用0.1%蛋白胨水溶液500冲洗，冲洗后取出滤膜面朝上贴于营养琼脂培养基平板上培养土霉素胶囊称取供试品10g，加PH7.6磷酸盐缓冲液100ml混匀作1：10的供试液取1：10供试液上清液01ml/膜加入到200m/PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液中制备成稀释供试液，摇匀至薄膜过滤器中2000m/PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗，贴于营养琼脂培养基平板上培养培养红霉素栓称取供试品10g，置（内含玻璃珠若干）锥形瓶内，加无菌十四烷酸丙脂10ml至45水浴中10分钟使溶混

23、匀乳化，在加PH7.0无菌NaCl蛋白胨缓冲液90ml混匀放置使油水明显分层，作为1：10的供试液取1：10供试液水层1ml，加入到200ml温度为45PH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液中，摇匀至薄膜过滤器中用1000ml的0.1%无菌山梨酯80冲洗，冲洗后取出滤膜面朝上贴于营养琼脂培养基平板上培养培养脑心清胶囊称取供试品10g，加PH7.8磷酸盐缓冲液100ml混匀作1：10的供试液取1：10供试液0.2ml/皿置直径90mm的无菌平皿中贴于营养琼脂培养基平板上培养培养取1：10供试液离心液1ml加入薄膜过滤器中，过滤取出滤膜面朝上贴于营养琼脂培养基平板上培养甲芬那酸分散片称取供试品10g，加

24、PH7.0无菌NaCl蛋白胨缓冲液100ml，制成1：10的供试液。 取1：10供试液离心5min，取上清液1ml/皿置直径90mm的无菌平皿中贴于营养琼脂培养基平板上培养培养取1：10供试液1ml/皿置直径90mm的无菌平皿中培养题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 12页8.1.2供试液的稀释（10倍递增稀释法）取23支灭菌试管，分别加入9ml灭菌稀释剂加完稀释剂后，试管塞应立即塞上。另取1支1ml灭菌吸管吸1:10均匀供试液1ml,加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中摇匀,即为1:100供试液，以此类推，根据供试品的污染程度，可稀释至1：102、1：1

25、03、1：104等适宜稀释级（至少共3级）每递增1稀释级，必须另换一支吸管。8.1.3注平皿：在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管吸取各级稀释液各1ml至每个灭菌平皿中，每一稀释级注23个平皿，注平皿时，将1ml供试液慢慢全部 注入平皿中，同时作阴性对照（待各级稀释液注皿完毕后，用1支1ml吸管吸取稀释剂各1ml，分别注入4个平皿中，其中2个作细菌数阴性对照，另2个作霉菌，酵母菌数阴性对照）。8.1.4注培养基：将预先配制好的培养基（细菌计数用营养琼脂、霉菌、酵母菌计数一般用玫瑰红钠琼脂）溶化，冷至45时倾注上述各个平皿约15ml，以顺时针或反时针方向快速旋转平皿（勿使培养基溢出）使供试

26、液与培养基摇匀放置待凝后，倒置培养。8.1.5培养：细菌计数置于3035培养箱中培养48小时，霉菌、酵母菌计数置于2528培养箱中培养72小时。8.1.6菌落计数：一般将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼点计，以透视光衬以暗色背景，仔细观察计数，必要时借助于放大镜菌落计数器和显微镜观察。题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第13页8.1.7菌数报告规则：细菌、酵母菌数选取平均菌落数在30300之间的稀释级，霉菌数选取平均菌落数在30100之间的稀释级作为菌数报告的依据。8.1.7.1当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍

27、数的值报告菌数。8.1.7.2当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定，视两者比值而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数；当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。8.1.7.3当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数值的值报告菌数。8.1.7.4如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以小于1乘以最低稀释倍数值的值报告菌数。8.1.7.5薄膜

28、过滤若滤膜无菌落生长，以小于1报告菌数，或小于1乘以稀释倍数值的值报告菌数。8.1.8结果报告：8.1.8.1菌落数在100以内时，按实有数据报告。8.1.8.2菌落数大于100时，取两位有效数字报告，第三位按数字修约题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 14页规则处理。8.1.9复试：供试品细菌、霉菌、酵母菌数其中任一项一次检验不合格，应重新取2倍包装量供试品，依法作单项复试两份，以三次检验结果的均值报告。8.2控制菌检查8.2.1、 对照用菌液：8.2.1.1大肠埃希菌对照用菌液 取大肠埃希菌CMCC44102的营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营

29、养肉汤培养基内，361培养1824小时后，用0.9无菌氯化钠溶液稀释至1：106，使对照菌液加入量含菌50100个（一般用量为0.1ml），其菌数在做阳性对照的同时用营养琼注皿或平板涂布，经培养后计数确定。8.2.1.2铜绿假单胞菌对照用菌液 铜绿假单胞菌CMCC（B）10104营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，于36培养1824h后，用0.9无菌氯化钠溶液稀释至1：106 ，使对照菌加入量含菌50100个（一般用量为0.1ml），菌数在做阳性对照实验的同时用营养琼脂平板涂布经培养后计数确定。8.2.1.3金黄色葡萄球菌对照用菌液 取金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003营

30、养琼脂斜面新鲜培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基中，361培养1824h，用0.9无菌题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 15页氯化钠溶液，按10倍递增稀释至1：106，对照菌加入量为50100个（一般用量为1：106 0.1ml），同时用营养琼脂平板计数。8.2.1.4大肠菌群对照用菌液分别取大肠埃希菌，金黄葡萄球菌的营养琼脂斜面培养物少许，各接种至5ml营养肉汤培养基内，置361培养1824h，取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每人1ml含菌10100cfu的菌悬液，其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿，经培养后计数确定。 8

31、.2.2大肠埃希菌检查法：8.2.2.1检验程序 供试品 供试液 BL增菌培养液 361 1824 h MUG蛋白胨 EMB 361 5、24h 或麦康凯琼脂平板 361 1824 h 疑似菌落纯培养 MUG 阳性、靛基质阳性 361 1824h 报告 MUG 阴性、靛基质阴性 革兰染色、乳糖靛基质 甲基红、VP试验、 枸橼酸盐利用 MUG 阳性、靛基质阴性 361 1824h MUG 阴性、靛基质阳性 报告 题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 16 页8.2.2.2各供试品的检验方法:供试品大肠埃希菌检验方法益肝灵胶囊甲芬那酸分散片甲芬那酸片甲芬那酸

32、胶囊吲哚美辛胶囊维生素C脑心清胶囊取1：10供试液10ml加入到100ml胆盐乳糖增菌培养基中培养盐酸丁卡因胶囊取1：10供试液10ml加入到薄膜过滤器中，用0.1%蛋白胨水溶液300ml冲洗，冲洗后取出滤膜放入100ml胆盐乳糖增菌培养基中培养复方磺胺甲噁唑胶囊取1：10供试液上清液10ml加入含1%对氨基苯甲酸8ml的200ml胆盐乳糖菌培养基中培养联磺甲氧苄啶胶囊取1：10供试液10ml加入含1%对氨基苯甲酸5ml到400ml胆盐乳糖增菌培养基中培养土霉素胶囊取1：10供试液10ml加入到200mlPH7.0无菌氧化钠-蛋白胨缓冲液中，制备成稀释供试液混匀，至薄膜过滤器中用1500mlP

33、H7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中冲洗，冲洗后取出滤膜放入100ml胆盐乳糖增菌培养基中培养红霉素栓取1：10的供试液10ml水层加入到200ml的温度为45PH7.0无菌氯化钠、蛋白胨缓冲液中，混匀，至薄膜过滤器中用1000ml的1%无菌聚山梨脂-80溶液冲洗后取出滤膜放入100ml胆盐乳糖菌培养基中培养8.2.2.3增菌培养：取胆乳盐糖（BL）培养基3瓶，每瓶各100ml，2瓶分别加入规定量的供试液，其中一瓶加入对照菌50100个作阳性对照，第三瓶加入与供试液等量的稀释剂作为阴性对照，37培养1824小时（必要时可延长时48h），阴性对照应无菌生长。摇匀上述BL增菌培养液，以灭菌吸管取供试

34、品胆盐乳糖增菌培养液，供试品阳性对照培养液，阴性对照培养液各0.2ml，分别接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外灯下观察有无兰白色荧光（呈荧光为MUG阳性，不呈荧光为MUG阴性），题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 17页然后加靛基质试液45滴于上述MUG管内观察液面颜色，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性，报告检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，报告未检出大肠埃希菌。8.2.2.4分离培养：如呈现MUG阳性，靛基质阴性或MUG

35、阴性，靛基质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养1824h，观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠埃希菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，可判为供试品1g或1ml未检出大肠埃希菌。当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠埃希菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染色，镜检IMViC试验。8.2.2.5纯培养：以接种针轻轻接触单个疑似菌落的中心，沾取培养物，应挑选23个疑似菌落，分别接种营养琼脂斜面，培养1824h，作以

36、下检查，如平板上无单个可疑菌落，但有可疑菌团，应沾取可疑菌团少许，重新划线于EMB琼脂平板培养1824h，再挑选单个疑似菌落，作以下检查。8.2.2.6革兰染色 镜检：（1） 以接种环沾取无菌水于洁净载坡片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 18页火焰23次（载坡片不烫手）固定。b.滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。c.滴加碘液。媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。d.滴加95乙醇，脱色2030s，水洗。e滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。f染色结果：革兰阳性

37、菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色，大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌，或球杆菌状，亦有杆菌状。8.2.2.7生化试验：a.乳糖发酵试验：取上述斜面培养物，接种于乳糖发酵管培养2448h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色，指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色）产气。b.靛基质试验（I）：取上述斜面培养物，接种于蛋白胨水培养基，培养2448h，沿管壁加入欧波试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。98的大肠埃希菌靛基质试验为阳性，一般24h即可出现阳性结果，以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查，如靛基质是阴性，余下的蛋白胨水培养物再培养24h，作靛基质试验。c.甲c验（M）：取上述

38、斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养482h，于培养液中加入甲基红指示液23滴（约每ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或桔红色为题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 19页阳性，呈黄色为阴性。d.乙酰甲基甲醇生成试验（VP）：取上述斜面培养物，接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养482h，于2ml培养液中加入萘酚乙醇试液1ml，摇匀，再加40氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）内出现红色应判为阳性；无红色反应为阴性。e.枸橼酸盐利用试验（C）：取上述斜面培养物，接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养24天

39、，培养基斜面有菌苔生长，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变，无菌苔生长为阴性。8.2.2.8结果判断：a.当阴性对照试验呈阴性，阳性对照试验MVG呈阳性、供试品MUG阳性、靛基质阳性，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛基质阴性，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。b.MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为，革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌；MUG阴性、靛质阳性、IMViC试验为，革兰阴性杆菌，报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。c.供试品培养检查不符合a、b二项中的任一项，报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。e.当阴性对照有菌生长或阳

40、性对照未生长或生长但菌落不是大肠埃题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 20页希菌，不能作出检验报告。8.2.3铜绿假单胞菌检查法铜绿假单胞菌按增菌，分离，纯培养，革兰染色镜检及生化试验等步骤进行检验。8.2.3.1供试品的检验方法：供试品铜绿假单胞菌的检验方法盐酸丁卡因胶浆取1：10供试液10ml加入到薄膜过滤器中用0.1%蛋白胨水溶液300ml冲洗，冲洗后取出滤膜放入100ml胆盐乳糖增菌培养基中培养红霉素栓取1：10的供试液10ml水层加入到200ml的温度为45PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀至薄膜过滤器中用1000ml的0.1%无菌聚山

41、梨脂-80溶液冲洗冲洗后取出滤膜放入100ml胆盐乳糖增菌培养基中培养8.2.3.2增菌培养：取胆盐乳糖培养基3瓶，每瓶100ml，2瓶分别加入1：10供试液10ml，其中一瓶加入对照菌50100个作为阳性对照。第三瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。于36培养1824h。阳性对照应生长良好，阴性对照菌应无菌生长。8.2.3.3分离培养：轻轻摇动上述增菌培养液，以接种环取12环培养液，划线接种于溴代十六烷基三甲胺琼 脂平板，于36培养1824h。铜绿假单胞菌在该培养基平板上的典型菌落为扁平、园形或无定形，边缘不齐，光滑湿润，呈灰白色，周边略呈扩散现象，在菌落相邻处常有融合现象。菌落周围常有水

42、溶性蓝绿色素扩散，使培养基显蓝绿色但亦有不产色素的菌株。菌落还有粗型和粘液型等，应注意挑选。当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品平板无菌题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 21 页落生长或无疑似菌落生长，可报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单包菌。8.2.3.4纯培养：供试品分离平板生长典型菌落或呈疑菌落时，以接种针轻轻接触，单个菌落的表面中心，沾取培养物，应挑取23个疑似菌落，分别接种营养琼 脂斜面培养，作以下检查。8.2.3.5 革兰染色（同大肠埃希菌检验法）8.2.3.6镜检：铜绿假单胞菌为革兰阴性，无芽孢杆菌，单个，成对或成短链排列。8.2.

43、3.7氧化酶试验：取一小块白色洁净的滤纸置平皿内，以无菌玻璃棒挑取营养琼脂斜面培养物少许，涂在滤纸上，随即滴加1滴新配制的1二盐酸二甲基对笨二胺试液，在30秒内，纸片上的培养物出现粉红色，逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应。本试验应注意：3 试验菌落（苔）必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠。4 试验避免与铁、镍等金属接触，不可用普通接种针（环）（白金材料除外）挑取菌落（苔）否则出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒。5 试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用。（4）反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反

44、应。8.2.3.8绿脓菌素试验 取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 22页用培养基（PDP）斜面上，361培养24h后，观察斜面有无色素，如有色素，在试管内加氯仿35ml，以无菌玻璃棒搅碎培养基并充分振摇。使培养物中的色素完全萃取在氯仿液内。静置片刻，待氯仿分层，用吸管将氯仿移至另一试管中，加入盐酸试液（1mol/L）约1ml，振摇后静置片刻，如在盐酸液层内出现粉红色、即为阳性反应，无粉红色出现为阴性反应。如培养基斜面无色素产生，应于室温培养12天再按上述试验。凡经再次检验，绿脓菌素试验仍为阴性者应继续以下试验。8

45、.2.3.9硝酸盐还原产气试验 以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物接种于硝酸盐胨水培养基中，置361培养24h，观察结果。如果在培养基内的小倒管中有气体产生，即为阳性反应，表明该培养物能还原硝酸盐，并将亚硝酸盐分解产生氮气。小倒管内无气泡者为阴性反应。8.2.3.10 42生长试验 以接种环沾取少许营养琼脂斜面培养物于0.9无菌氯化钠液中，制成菌悬液。然后将菌悬液划线接种于营养琼脂斜面上，立即置411的恒温水浴箱内，务使整个斜面浸没在水浴中，培养2448h小时，斜面如有菌苔生长者为阳性反应；无菌苔生长为阴性反应。8.2.3.11明胶液化试验:以接种针沾取营养琼脂斜面培养物少许，穿刺接种于明胶培

46、养基中，穿刺深度应接近培养基的底部，于361题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 23页培养24h。取出放入冰箱内1030min。如培养基呈溶液状，即为明胶液化试验阳性反应；如明胶呈凝固状,为阴性反应。本试验应注意：a.本试验接种前，培养基应为固态，否则需将培养基置冰箱内使之凝固后，再穿刺接种。b.试验应同时设未接种细菌的的阴性对照管，与试验管同时培养并观察结果。8.2.3.12结果报告a.供试品培养物经证实为革兰阴性杆菌，氧化酶试验及绿脓菌素试验皆为阳性者，即报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。b.供试品培养物氧化酶试验阳性，镜检为革兰阴性杆菌的培

47、养物，绿脓菌素试验阴性时，其硝酸盐还原产气试验、41生长试验及明胶液化试验皆为阳性时，亦报告1g或1ml供试品检出铜绿假单胞菌。c.凡与a与b结果不符时报告1g或1ml供试品未检出铜绿假单胞菌。8.2.4金黄色葡萄球菌检查 8.2.4.1供试品的检验方法：供试品金黄色葡萄球菌检验方法盐酸丁卡因胶浆取1：10供试液10ml加入到薄膜过滤器中用0.1%蛋白胨水溶液300ml冲洗，冲洗后取出滤膜放入100ml营养肉汤培养基中培养红霉素栓取1：10的供试液10ml水层加入到200ml的温度为45PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀至薄膜过滤器中用1000ml的0.1%无菌聚山梨脂-80溶液冲洗，

48、冲洗后取出滤膜放入100ml营养肉汤培养基中培养8.2.4.2增菌培养 取营养肉汤（或亚碲酸钠肉汤）培养基3瓶，每题 目微生物限度检查法操作规程共29 页文件编码JHCZZL114R01第 24页瓶100ml，2瓶分别加入10ml供试液，其中1瓶加入50100个对照菌作为阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的PH7.0无菌氯化钠缓冲液蛋白胨缓冲液或磷酸盐缓冲液（PH7.2） 作为阴性对照，置361培养1824h（必要时可延至48h）。阴性对照应无菌生长。8.2.4.3分离培养 将上述供试品增菌培养液及阳性对照增菌液轻轻摇动，以接种环沾取12环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平

49、板上，置361培养2472h。当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表1所列特征，可报告为1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。当供试品分离平板生长菌落与表1所列特征相似的典型形态，应挑取该菌落作纯培养，对非典型形态的菌,可增加血琼脂平板分离鉴别。 表1 金黄色葡萄球菌在三种选择性培养基上菌落形态特征培养基菌落形态特征卵黄氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有分解卵磷脂后产生的乳浊圈菌落直径12mm。甘露醇氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有黄色环，菌落直径0.71mm。血琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周

50、有溶解红细胞后产生的透明溶血环，菌落直径较大，24mm。 当阳性对照平板未生长或生长菌落经检查不是金黄色葡萄球菌时，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。题 目微生物限度检查法操作规程共 29 页文件编码JHCZZL114R01第 25 页8.2.4.5纯培养 当供试品分离平板生长菌落与表1所列菌落特征相似或疑似时，应选取23个以上菌落，分别用接种针，轻轻沾取菌落中心表面培养物，接种于营养琼脂斜面上，于361培养1824h其培养物作革兰染色，镜检及血浆凝固酶试验。8.2.4.6革兰染色:以接种环沾取无菌水洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成

51、均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰23次（载玻片不烫手）固定。a.滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。b.滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。c.滴加95乙醇，脱色2030s，水洗。d.滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。8.2.4.7镜检 金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列。8.2.4.8血浆凝固酶试验 取无菌试管（10100mm）3支，各加入血浆：0.9无菌氯化钠溶液（1：1）0.5ml，1支加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，其余2支作对照管：1支加入金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对照；另一支加入营养肉汤或0