表观遗传与花期调控-2003.

1、LHY泛素化通过泛素化通过SINAT5调节调节 开花时间，并被开花时间，并被DET1抑制抑制 报告人 ：刘文辉 小组成员:苗 亮 提纲 简介 实验及结果 讨论 简介 1、晚期细长下胚轴（晚期细长下胚轴（LATE ELONGATED HYPOCOTYL，LHY）是拟南芥生物钟的关键组成部 分，其是影响生物活动的时间组织以及预期的光 和温度条件中的昼夜变化的生理适应。其由早晨 定时的CAB1（TIMING OF CAB1，TOC1）促进表达， LHY蛋白结合到TOC1基因的启动子以抑制其表达。 因此，LHY和TOC1对彼此的转录产生相互影响。 LHY的翻译水平的表达也由光调节，尽管这种反应 的机制

2、尚未被表征。 2、泛素泛素是一种小的多肽，主要功能是标记需要分 解掉的蛋白质，泛素化泛素化是泛素蛋白的翻译后修饰， 导致26S蛋白酶体复合物降解靶蛋白。 E3泛素连接酶泛素连接酶SINAT5（果蝇SINA环指蛋白的拟南 芥同源物）直接与LHY（一个昼夜节律振荡器的组件 ）和DET1（一种光调节基因表达的负负调节器）相互 作用。SINAT5具有E3泛素蛋白连接酶活性为开花位 点C（FLOWERING LOCUS C，FLC），一种花抑制子， 表明sinat5突变体的延迟开花。 DE黄化（黄化（DE-ETIOLATED1，DET1）被称为光信号 中间体，尽管其功能未得到充分表征。 已经知道 DET

3、1的人同源物通过组装含有紫外线损伤的DNA 结合蛋白1（DNA binding protein 1，DDB1）的泛 素连接酶复合物来促进泛素化和转录因子c-Jun的 降解。拟南芥DET1蛋白质是已知的促进泛素化和 通过与COP10（一种与COP1和COP9信号体一起行 动以抑制形态发生的泛素共轭酶变体）联合使特 定目标蛋白水解降解。 结果一：SINAT5突变体显示晚开花 总叶数量 实验：实验：野生型（Col-0）和sinat5植物在 长日照条件下（16天/ 8夜）在土壤中 生长。开花时间通过计数当花序出现 时存在的莲座叶的数量进行研究。在 实验中使用每种类型（野生型或sinat5 突变体）的2

4、0株植物。 结果：结果：在长日照条件下生长的sinat5突 变体的开花时间。 在sinat5突变体中观察到晚花（A）。 通过计数当花序出现时存在的莲座叶 数进行研究开花时间（B）。 野生型 （Col-0）和sinat5植物的数量显着不同 （P 0.0001，t检验，n = 20）。 条表 示标准误差。 结果二：SINAT5与LHY和DET1物理相互作用 实验：酵母双杂交测定 使用基于GAL4的双杂交系统（Clontech，文库）进行酵母双杂交 测定。将全长LHY或DET1和SINAT5 cDNA片段克隆到pGAD424和pGBT8（ Clontech）中，以分别产生构建体AD（激活结构域）-D

5、ET1或AD-DET1和 BD（结合结构域）-SINAT5。SINAT5缺失突变体也通过PCR产生并克隆到 pGBT8中。为了产生BD-SINAT5（SN）和BD-SINAT5（SC），分别将编码 SINAT5的氨基酸1-158的N末端片段和编码SINAT5的氨基酸156-310的C末端 片段分别克隆入pGBT8。此外，为了产生BD-SINAT5（SR）和BD-SINAT5（ SZ），分别编码环指基序（氨基酸1-100）和锌指基序（氨基酸83-182） 的N-末端片段，分别克隆到pGBT8。使用乙酸锂方法将所有构建体转化到 酵母菌株AH109中，并使酵母细胞在基本培养基（Leu / Trp）上

6、生长。将 转化体接种在基本培养基（Leu / Trp / His（20mM 3-AT（3-氨基-1,2,4-三 唑）上以测试LHY或DET1与SINAT5之间的可能相互作用。 3-AT是一种毒剂，酵母细胞对是一种毒剂，酵母细胞对3-AT的抑制水平体现了蛋白的抑制水平体现了蛋白-蛋白相互作蛋白相互作 用的强度。用的强度。 结果二：SINAT5与LHY和DET1物理相互作用 在将构建体导入酵母菌株AH109中并在基本培 养基（Leu / Trp）上选择转化体（图2B）后， 检查它们的相互作用。发现全长SINAT5与全长 LHY相互作用（图2C）。特别地，LHY与SINAT5 （SR）的环指基序和S

7、INAT5（SZ）的锌指基序 （图2C）相互作用。我们还检查DET1是否与 SINAT5相互作用，因为DET1直接影响LHY稳定 性（Song等人）。 结果表明DET1也与SINAT5 强烈相互作用。然而，有趣的是，与LHY不同， DET1仅仅与含有SINAT5（SR）的环指基序的N-末 端区域相互作用; 不与含有SINAT5（SZ）的锌 指基序的N末端区相互作用（图2C）。 图2. SINA5与LHY和DET1的物理相互作用 结果三：LHY是SINAT5的底物 实验：体外泛素化测定 体外泛素化在含有10mM HEPES（pH7.5），100mM NaCl ，5mM MgCl 2，2mM Zn

8、Cl 2，2mM ATP，100ng纯化的GST- LHY-Myc（或GST- DET1-Myc），500ng纯化的GST-SINAT5（E3 ），25ng兔E1（Affiniti），25ng UbcH5B（Affiniti）和 10gHis6-泛素（Sigma-Aldrich法），总体积30L的溶液中测定 。 在30下孵育2小时后，在10SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离 反应混合物，并通过western blot法检测泛素化的GST-LHY-Myc 或GST-DET1-Myc。 结果三：LHY是SINAT5的底物 （A）在10SDS-PAGE上分离纯化 的GST-LHY-Myc，GST-DET1

9、-Myc和 GST-SINAT5。（B）在存在或不存在 泛素活化酶E1，泛素缀合酶E2， His-泛素和GST-LHY-Myc或GST-DET1- Myc的情况下测定SINAT5 E3泛素化 活性。反应后，通过使用抗-Myc抗 体的western印迹分析检测泛素化的 LHY或DET1。 LHY由SINZT5泛素化， 但DET1不是。星号表示泛素化的 LHY。底物表示GST-LHY-Myc或GST- DET1-Myc。 图3. LHY通过SINAT5在体外的泛素化。 结果三：LHY是SINAT5的底物 SINAT5和LHY或DET1在体内的直接相互作用表明 SINAT5可以作为用于LHY或DET

10、1的E3泛素连接酶。 产生以下重组蛋白质GST-SINAT5，GST-LHY-Myc和 GST-DET1-Myc（图3A），以测试SINAT5是否确实 是LHY或DET1的E3泛素连接酶。体外泛素化实验显 示，纯化的GST-LHY-Myc在存在E1和E2活性的情况 下通过SINAT5多聚泛素化（图3B）。然而，用 SINAT5没有观察到DET1多聚蛋白化。 结果四: DET1抑制E3泛素连接酶SINAT5的活性 图4. 在体外通过SINAT5的DET1抑制 LHY泛素化。（A）研究DET1影响 LHY的SINAT5 E3泛素化活性。以0.1 至1.0mg的浓度将纯化的GST-DET1- HA加

11、入到反应中。反应后，使用 抗-Myc抗体通过蛋白质印迹分析 检测泛素化的LHY，并通过使用抗- HA抗体的western印迹分析检测 DET1。（B）也研究了透析缓冲液 对LHY泛素化的影响。 星号表示泛 素化的LHY。 图4 结果四: DET1抑制E3泛素连接酶SINAT5的活性 检测DET1对LHY泛素化的影响。我们的结果表明， LHY泛素化随着反应中DET1蛋白质量的增加而逐渐被 抑制（图4A）。在该实验中使用的所有纯化的蛋白 质在反应前透析。因此，为了证实DET1对SINAT5活 性的影响，我们还向反应中加入等体积的透析缓冲 液，发现缓冲液对LHY泛素化没有影响（图4B）。 这表明，L

12、HY泛素化确实被DET1蛋白阻断，DET1保 护LHY在通过SINAT5多聚泛素化后避免被26S蛋白体 复合物降解。 讨论 在本文中，我们报告SINAT5可以控制LHY介导的开花。 我们 还证明SINAT5的E3连接酶活性被DET1抑制。我们以前的结果充 分表明SINAT5参与开花时间，因为其对花抑制因子FLC泛素化活 性。在本实验中，我们发现与野生型植物相比，SINAT5基因中 的T-DNA插入导致晚开花（图1）。 LHY蛋白已被广泛研究，尽 管迄今为止的大多数研究集中于昼夜节律。最近，据报道，LHY 参与调节开花时间，因为过表达时其延迟开花。此外，已经表 明LHY稳定性由泛素化途径调节。鉴

13、于这些发现，我们推测 SINAT5作为LHY的E3泛素连接酶。因此，我们测试SINAT5是否参 与LHY的量的控制。如预期的，我们的结果显示，SINAT5与LHY 强烈相互作用并且对LHY具有E3泛素连接酶活性（图2和3），这 意味着SINAT5控制LHY介导的从营养阶段到花相的变化。 在拟南芥中，几个研究已经表明DET1参与通过多聚 泛蛋白化后的蛋白酶降解调节蛋白质稳定性。 Song等人也证明DET1是LHY的正调节物，因为LHY 对det1突变体中26S蛋白体的降解更敏感，表明 DET1可以是SINAT5的抑制剂或LHY的保护剂。酵母 双杂交测定和体外泛素化测定显示DET1不是 SINAT5的底物（图3A），但它通过与SINAT5的直 接相互作用（图2）抑制SINAT5活性（图4A）。这 些数据证明 DET1通过与SINAT5的直接相互作用阻 断SINAT5的LHY泛素化，从而保护LHY免受26S蛋白