整理实验设计一

1、整理实验设计一喷施小分子有机物对小油菜生长发育和养分吸收的影响一、土壤样品的采集和处理1、供试土壤的选择 供试土壤：中国农业科学院德州实验站禹城实验基地多年匀地试验耕层土壤，质地为轻壤。 主养分含量：全氮 0. 65 g / kg、速效磷（ P2 O5 ）16. 29 mg / kg、速效钾（ K2 O）90. 15 mg / kg、有机质 9. 43g / kg、PH 7. 98。1.1土壤全氮测定：半微量开氏法【主要仪器】消煮炉；50ml或100ml开氏瓶；半微量定氮蒸馏装置；150ml锥形瓶；5ml或10ml半微量滴定管。试剂：（1）硫酸。 =1.84gml-1，化学纯；（2）10mol

2、L-1NaOH溶液。 称取NaOH（AR）400g（工业用固体NaOH，称420g），于硬质玻璃烧杯中，加蒸馏400ml溶解，不断搅拌，以防止烧杯底角固结，冷却后倒入塑料试剂瓶，加塞，防止吸收空气中的CO2，放置几天待Na2CO3沉降后，将清液虹吸入盛有约160ml无CO2的水中，并以去CO2的蒸馏水定容1L加盖橡皮塞（浓度约为40% W/V）。（3）甲基红溴甲酚绿混合指示剂。即0.099g溴甲酚绿和0.066g甲基红于玛瑙研钵中，加少量95%酒精，研磨至指示剂完全溶解，用95%乙醇定容100ml。此指示剂变色范围pH 4.4(红)5.4（蓝），贮存期不超过2个月。（4）20gL-1 H2BO

3、3指示剂注1。称取硼酸（分析纯）20g溶于约950ml水中，加热搅动直至H3BO3溶解，冷却后，加入混合指示剂20ml混匀（每10mlH3BO3加入2ml指示剂），并用稀酸或稀碱调节至紫红色（pH约4.5），加水稀释至1L混匀，贮存在塑料瓶中备用。宜现配。（5）混合催化剂。K2SO4:CuSO4:Se=100:10:1即100g K2SO4（化学纯）、10g CuSO4 5H2O（化学纯）、和1g Se粉混合研磨，通过80号筛充分混匀（注意戴口罩），贮于具塞棕色磨口瓶中。消煮时每毫升H2SO4加0.37g混合加速剂。（6）高锰酸钾溶液。25g高锰酸钾（分析纯）溶于500ml无离子水，贮于棕色瓶

4、中。（7）1:1硫酸（化学纯、无氮、=1.84gml-1）。硫酸与等体积水混合。（8）还原铁粉。磨细通过孔径0.15mm（100号）筛。（9）辛醇。（10）0.01 molL-1（1/2H2SO4）标准液。量取H2SO4（化学纯、无氮、=1.84gml-1）2.83ml，加水稀释至5000ml，然后用标准碱或硼砂标定之，得0.02 molL-1（1/2H2SO4）标准溶液。将0.02 molL-1（1/2H2SO4）标准溶液用水准确稀释一倍。标定：平行3份，空白3份。称取1.9068g硼砂注2（Na2B4O710H2O），精确至0.0001g，加水溶解后稀释至500ml，得0.0500mol/

5、L硼砂标准溶液。吸取20.00ml硼砂标准溶液置于150ml锥形瓶中，加1滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂，用盐酸标准溶液滴定至溶液由蓝色变为紫红色为终点。同时做空白试验。盐酸标准溶液的浓度按下式计算：式中：C盐酸标准溶液浓度，mol/L；C1硼砂标准溶液浓度（0.02000），mol/L；V1硼砂标准溶液体积，ml；V2盐酸标准溶液用量，ml；V0空白试验消耗盐酸标准溶液体积，ml；【测定步骤】（1）称取通过孔径0.149mm筛（即100目筛） 注3 风干土样1.0000g（含氮约1mg）注4，同时测定土样水分含量，最后换算成烘干样计算结果。（2）土样消煮注5不包括硝态氮和亚硝态氮的消煮：将土样

6、小心移入干燥的消煮管底部，加少量无离子水（0.51ml）湿润土样后注6，加入加速剂1.85g和浓硫酸5ml，摇匀，将开氏瓶倾斜置于变温电炉上，最初宜用低温，待瓶内无泡沫发生（约10min15min），提高温度（375，4h）使消煮的土液保持微沸，加热的部位不超过瓶中的液面，以防瓶壁温度过高而使铵盐受热分解，导致氮素损失。消煮的温度以硫酸蒸气在瓶颈上部1/3处冷凝回流为宜。待消煮液和土粒全部变为灰白稍带绿色后，再继续消煮1h。（个别土样如果分解困难，消煮液转清亮的过程较慢，必须延长半小时左右。）消煮完毕，取下凯氏瓶冷却，准备蒸馏。在消煮土样的同时，做两份空白测定，除不加土样外，其他操作皆与测定土

7、样相同。包括硝态氮和亚硝态氮的消煮：将土样送入干燥的开氏瓶（或消煮管）底部，加高锰酸钾溶液1ml，摇动开氏瓶，缓缓加入1:1硫酸2 ml，不断转动开氏瓶，然后放置5min，再加入1滴辛醇。通过长颈漏斗将0.5g(0.01g)还原铁粉送入开氏瓶底部，瓶口盖上小漏斗，转动开氏瓶，使铁粉与酸接触，待剧烈反应停止时（约5min），将开氏瓶置于电炉上缓缓加热45min（瓶内土液应保持微沸，以不引起大量水分丢失为宜，205）。停火，待开氏瓶冷却后，通过长颈漏斗加加速剂2g和浓硫酸5ml，摇匀。按上述的步骤，消煮至土液全部变为黄绿色，再继续消煮1h。消煮完毕，冷却待蒸馏注7。在消煮土样的同时，做两份空白测定

8、。（3）氨的蒸馏蒸馏前先检查蒸馏装置是否漏气，并通过水的馏出液将管道洗净。待消煮液冷却后，用少量无离子水将消煮液定量地全部转入蒸馏器内，并用水洗涤开氏瓶45次（总用水量不超过3035ml）。若用半自动式自动定氮仪，不需要转移，可直接将消煮管放入定氮仪中蒸馏。在150ml锥形瓶中，加入5ml H2BO3指示剂混合液 注8，放在冷凝管末端，管口置于硼酸液面以上34cm处注9。然后向蒸馏室内缓缓加入20 ml 10 molL-1NaOH溶液，通入蒸汽蒸馏，待馏出液体积约50ml时，即蒸馏完毕。用少量已调节pH至 4.5的水洗涤冷凝管的末端。用滴定馏出液由蓝绿色至刚变为红色。记录所用酸标准溶液的体积（

9、ml）。空白测定所用酸标准溶液的体积，一般不得超过0.4ml。【结果计算】土壤全N量（gkg-1）=式中：V滴定试液时所用酸标准溶液的体积，ml；V0滴定空白时所用酸标准溶液的体积，ml；c0.01 molL-1（1/2H2SO4）或HCl标准溶液浓度；m风干土质量；K土壤水分系数。两次平行测定结果允许差为0.005%。2.2土壤中速效磷的测定（钼锑比色法）操作步骤：1.称取通过18号筛(孔径为1mm)的风干土样5g(精确到0.01g)于200ml三角瓶中，准确加入0.5mol/L碳酸氢钠溶液100ml,再加一小角勺无磷活性碳，塞紧瓶塞，在振荡机上振荡30分钟(振荡机速率为每分钟150180次

10、)，立即用无磷滤纸干过滤，滤液承接于100ml三角瓶中。最初78ml滤液弃去。2.吸取滤液10ml(含磷量高时吸取2.55ml；同时应补加0.5mol/L碳酸氢钠溶液至10ml)于50ml量瓶中，加硫酸钼锑抗混合显色剂5ml充分摇匀，排出二氧化碳后加水定容至刻度，再充分摇匀。3.30分钟后，在分光光度计上比色(波长660nm)，比色时须同时做空白测定。4. 磷标准曲线绘制：分别吸取5mg/L磷标准溶液0、1、2、3、4、5ml于50ml容量瓶中，每一容量瓶即为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L磷，再逐个加入0.5mol/L碳酸氢钠10ml和硫酸一钼锑抗混合显色剂5ml，然后同待

11、测液一样进行比色。绘制标准曲线。结果计算：土壤速效Pmg/kg=比色液mg/L定容体积/W分取倍数式中：比色液mg/L从工作曲线上查得的比色液磷的mg/L数；W称取土样重量(g)。分取倍数100/10土壤速效磷(P)mg/kg 等级5低510 中10 高2.3 土壤速效钾的测定：醋酸铵火焰光度计法主要仪器：1/1000天平、振荡机、火焰光度计、三角瓶(250ml,100ml)、漏斗(60ml)、滤纸、坐标纸、角匙、吸耳球、移液管(50ml)试剂：(1)中性1.0mol/LNH4OAc溶液，称77.08g NH4OAc溶于近1升水中，用稀HOAc或NH4OH调节至pH=7.0 , 用水定容至1升

12、。(2)K标准溶液 称取0.1907克KCl溶于1mol/L NH4OAc溶液中，完全溶解后用1mol/LNH4OAc溶液定容至1升，即为含100mg/L K的NH4OAc溶液。用时分别吸取此100mg/L K标准液0，2，5，10，20，40ml放入100ml容量瓶中，用1mol/L NH4OAc定容，即得0，2，5，10，20，40mg/L K标准系列溶液。操作步骤：称取风干土样(1mm孔径)5.g于150ml三角瓶中，加1mol/LNH4OAc溶液50.0ml(土液比为1：10)，用橡皮塞塞紧，在2025下振荡30分钟用干滤纸过滤，滤液与钾标准系列溶液一起在火焰光度计上进行测定，在方格纸

13、上绘制成曲线，根据待测液的读数值查出相对应的mg/L数，并计算出土壤中速效钾的含量。结果计算：土壤速效钾(K)mg/kg=待测液mg/L加入浸提剂毫升数/风干土重。2.4 土壤有机质的测定：重铬酸钾容量法仪器试剂：1.主要仪器:分析天平(0.0001g)、硬质试管、长条腊光纸、油浴锅 、铁丝笼(消煮时插试管用)、温度计(0360 )、滴定管(25ml)、吸管(10ml)、三角瓶(250ml)、小漏斗、量筒(100ml)、角匙、滴定台、吸水纸、滴瓶(50ml)、试管夹、吸耳球、试剂瓶(500ml)。2.试剂:(1)0.136mol/LK2Cr2O7H2SO4的标准溶液。准确称取分析纯重铬酸钾(K

14、2Cr2O7)40g溶于500ml蒸馏水中，冷却后稀释至1L，然后缓慢加入比重为1.84的浓硫酸(H2SO4)1000ml，并不断搅拌，每加入200ml时，应放置1020分钟使溶液冷却后，再加入第二份浓硫酸(H2SO4)。加酸完毕，待冷后存于试剂瓶中备用。(2)0.2mol/LFeSO4标准溶液。准确称取分析纯硫酸亚铁(FeSO47H2O)56g或硫酸亚铁铵Fe(NH4)2(SO4)26H2O80g，溶解于蒸馏水中，加3mol/L的硫酸(H2SO4)60ml，然后加水稀释至1L，此溶液的标准浓度，可以用0.0167mol/L重铬酸钾(K2Cr2O7)标准溶液标定。(3)邻啡罗啉指示剂。称取分析

15、纯邻啡罗啉1.485g，化学纯硫酸亚铁(FeSO47H2O)0.695g，溶于100ml蒸馏水中，贮于棕色滴瓶中(此指示剂以临用时配制为好)。测定步骤：1.在分析天平上准确称取通过60目筛子(0.25mm)的土壤样品0.10.5g(精确到0.0001g)，用长条腊光纸把称取的样品全部倒入干的硬质试管中，用移液管缓缓准确加入0.136mol/L重铬酸钾硫酸(K2Cr2O7-H2SO4)溶液10ml，(在加入约3ml时，摇动试管，以使土壤分散)，然后在试管口加一小漏斗。2.预先将液体石蜡油或植物油浴锅加热至185190，将试管放入铁丝笼中，然后将铁丝笼放入油浴锅中加热，放入后温度应控制在17018

16、0，待试管中液体沸腾发生气泡时开始计时，煮沸5分钟，取出试管，稍冷，擦净试管外部油液。（充分摇匀后加浓硫酸60mL，缓缓摇动1min，加一弯颈小漏斗，置于沸水中保温30min，每隔约5min摇动一次。取出冷却至室温，用水冲洗小漏斗，洗液承接于三角瓶中。）3.冷却后，将试管内容物小心仔细地全部洗入250ml的三角瓶中，使瓶内总体积在6070ml,保持其中硫酸浓度为11.5mol/l,此时溶液的颜色应为橙黄色或淡黄色。然后加邻啡罗啉指示剂34滴，用0.2mol/l的标准硫酸亚铁(FeSO4)溶液滴定，溶液由黄色经过绿色、淡绿色突变为棕红色即为终点。4.在测定样品的同时必须做两个空白试验，取其平均值

17、。可用石英砂代替样品，其他过程同上。结果计算：在本反应中，有机质氧化率平均为90%，所以氧化校正常数为10090，即为1.1。有机质中碳的含量为58%，故58g碳约等于100g有机质，1g碳约等于1.724g有机质。由前面的两个反应式可知：1mol的K2Cr2O7可氧化32mol的C，滴定1molK2Cr2O7，可消耗6mol FeSO4，则消耗1molFeSO4即氧化了3216C=14C=3计算公式：有机质g/kg= (V0-V)N0.0031.7241.1)样品重1000式中：V0滴定空白液时所用去的硫酸亚铁毫升数。V滴定样品液时所用去的硫酸亚铁毫升数。N标准硫酸亚铁的浓度。mol/L2、

18、 选取的作物品种 供试作物：小油菜 品种：京华一号。3、 选取的肥料 供试小分子有机物：山梨醇（ 分析纯，分子量 182. 17）、 葡萄糖酸钠（ 分析纯，分子量218. 14）、 甘氨酸（ 分析纯，分子量 75. 07）。4、 底肥的施用： 底肥的处理：试验播种前，将过 2 mm 筛风干土壤与肥料混匀，装入内径为 24 cm、高 15 cm 的塑料盆中，每盆装风干土 3. 25 kg。 所用肥料：尿素（ N 46. 2% ）、磷酸二铵（18-46 -0）、硫酸钾（ K2 O 50% ），施肥量为每千克土施 N 0. 25 g、P2 O5 0. 15 g、K2 O 0. 15 g。 施用方法：

19、磷、钾肥一次性施入，氮肥施入 60% ，其余 40% 在出苗后第 35 天追施。5.选取的喷施阶段（喷施次数、喷施浓度、喷施过程注意事项不要互相影响） 喷施样品： 2013 年 6 月 29号播种出苗后 1 周定苗，每盆保留长势一致的健壮苗 4 株。 喷施阶段：小油菜三叶期 喷施次数：，每次20 mL / 盆，每隔7天喷施一次，共喷施4次。 喷施注意事项：喷施时用塑料薄膜遮盖盆中土壤和相邻盆，避免喷施液进入土壤和喷到相邻盆中的小油菜苗。其他管理按当地常规措施和方式。 收获时间：2013年8月13 日二、样品采集及测定样品收集：收获时、新鲜植株样品带回实验室测定项目：植株硝酸盐、可溶性糖及可溶性

20、蛋白 株高用直尺测量植株，从露出土壤根部至顶端的距离； 叶长 用直尺测量植株顶部倒数第 3 片展开叶叶尖至叶基距离；叶宽用直尺测量倒数第 3 片叶最宽部分距离；小油菜叶面积 = 叶长 x 叶宽 x 0. 7517。测定方法：小油菜植株体 NO3 含量采用水杨酸法测定，可溶性糖的测定采用蒽酮比色法，可溶性蛋白的测定采用考马斯亮蓝 G-250 染色法测定 ，叶片 SPAD 值的测定采用 SPAD-502仪测定，磷、钾含量的测定采用 H2 SO4 和 H2 O2 湿法消煮，用微量开氏法测定氮、钒钼黄比色法测定磷、火焰光度法测定钾。2. 可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）仪器和试剂：1 .仪器 （ 1)

21、分光光度计 (2 ）电子顶载天平 (3 ）三角瓶： 50m1 X 1 （ 4 ）大试管： 9 支 （ 5) 试管架，试管夹 （ 6 ）漏斗，漏斗架 （ 7 ）容量瓶： 50rnl X 2 （ 8 ）刻度吸管： 1m1X3 ， 2m1X1 ， 5mlX1 （ 9 ）水浴锅 2 .试剂 （ 1) 葡萄糖标准液： l00ug/ml (2 ）浓硫酸 (3) 蒽酮试剂 :0.2g 蒽酮溶于 100 ml 浓 H2SO4 中当日配制使用。 3 .材料 小麦分蘖节。 操作步骤 :1 .葡萄糖标准曲线的制作 取 7 支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液： 管号 1 2 3 4 5 6 7 葡萄糖

22、标准液（ ml ） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 蒸馏水（ ml ） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 葡萄糖含量（ ug ） 0 10 20 30 40 60 80 在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0m1 ，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸 l0min 取出，用流水冷却，室温放置 10min ，在 620 nm 波长下比色。以标准葡萄糖含量（ ug) 作横坐标，以吸光值作纵坐标，作出标准曲线。 2 .植物样品中可溶性糖的提取 将小麦分蘖节剪碎至 2mm 以下，准确称取 Ig, 放入

23、 50m1 三角瓶中，加沸水 25m1 ，在水浴中加盖煮沸 10min ，冷却后过滤，滤液收集在 50m1 容量瓶中，定容至刻度。吸取提取液 2m1 ，置另一 50m1 容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀测定。 3 .测定 吸取 lml 已稀释的提取液于大试管中，加入 4.Oml 蒽酮试剂，以下操作同标准曲线制作。比色波长 620nm ，记录吸光度，在标准曲线上查出葡萄糖的含量（ ug ）。 计算公式：3.测定蛋白质含量：考马斯亮蓝G-250染色法材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在1030mg/ml（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1