农杆菌转化法将拟南芥基因导入油菜

1、用农杆菌介导法将拟南芥用农杆菌介导法将拟南芥miR395d 基因转入油菜中的方法研究基因转入油菜中的方法研究 组员：组员： 内容目录 一一.目的基因的来源目的基因的来源 二二.转基因过程转基因过程 模板DNA的提取 引物的设计 PCR扩增 连接 转化 检测 三三.遗传转化遗传转化 1.农杆菌培养 2.无菌苗培养 四四.转化转化 五五.检测检测 目的基因的获取目的基因的获取 载体的构建载体的构建 目的基因的来源目的基因的来源 1.miRNA在调节植物对环境胁迫如干旱、盐 害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用 2.油菜与拟南芥同属于十字花科,亲缘关系亲缘关系 比较近比较近,且miR395在各物种间

2、序列保守序列保守。 3.采用PCR法法从拟南芥中克隆到miR395d前 体基因。 目的基因的获取目的基因的获取 模板模板DNA的提取的提取 引物的设计引物的设计 （CTAB法） PCR扩增扩增 上游引物上游引物S1:5-AGATCTATGTCACCCATCCTATCTT CCTCA-3; 下游引物下游引物S2:5-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA-ACCTGTA-3。 上游引物5端 加Bgl酶切位 点,下游引物5 端加入Spe酶 切位点，拟南 芥DNA为模板 466 bp左右 的miR395d 前体基因 载体的构建载体的构建 1. PCR产物的回收与测序 PCR产物产物 回收回收

3、 连接连接 转化转化 挑选单克隆挑选单克隆 鉴定鉴定 测序测序 琼脂糖凝胶电 泳回收试剂盒 克隆载体 pMD19TVector DH5感受 态细胞 含有Isopropyl- D - thiogalactoside(IPTG)、X- gal和Amp的LB平板 2.拟南芥miR395d前体基因过表达载 体构建 双酶切 回收 连接 表达 载体（pCAMBIA1304- miR395d） PCR和序列测 定 BglpCAMBIA1304； Spepre-miR395d 限制性内切酶 凝胶电泳 T4DNA连接酶16过夜 3. 根癌农杆菌介导法转化油菜 含pre-miR395d过表达载体的农杆菌 (5 m

4、L)LB+20 mg L-1Rif+50 mg L-1 Kan液体培养基 28 振荡培养1d 40 mL新鲜的上 述液体培养基中振荡培养3 5 h 对数 生长期 离心弃上清 5倍体积的 MS液体培养基悬浮菌液备用 农杆菌的培养 无菌苗的培养无菌苗的培养 油菜种子 70%乙醇表面消毒30 s 1 g L-1 HgCl2 消毒5 min 冲洗 种子萌发(MS) 25 光照培养 7d 转化转化 子叶和下胚轴 预培养基黑暗预培养 3 d 浸入侵染液（子叶浸泡5 min, 下胚 轴浸泡30 s） MS固体培养基黑暗培养 2 d 脱菌培养基6d 筛选培养 基 15 d 换1次培养基 约1 2 cm的绿芽切

5、下转入壮苗培养基 分化芽苗长至3 5 cm时转入生根培养基(1 /2MS)中 4.转基因油菜PCR检测 油菜总DNA PCR（850bp） 上游引物S3:5-TGTGATGGTCCGATTGAG-3, 下游引物S2:5-ACTAGTCAACCTCGATCCTCTTA- ACCTGTA-3 CTAB法 阳性：模板质粒pCAMBIA 1304-miR395d ; 阴性：未经转化的油菜基因组DNA 拟南芥 miR 395d。 对照 拟南芥 miR 395d前体基因过表达载体构建 重组 pMD19T质粒 双酶切 回 收 插入表达载体pCAMBIA1304 PCR验证 得到条带（ 850bp） miR395d前 体基因已成功导入农杆菌,可用于油菜转化。 预期结果： 油菜外植体经预培养、农杆菌侵染、共培养 、脱菌培养、生根培养等一系列过程后部分 长成了潮霉素抗性植株。 Bgl和Spe 目的片段 转基因油菜转基因油菜 PCRPCR检测检测 提取潮霉素抗性植株及阴性对照的DNA , 以 质粒DNA为阳性对照, 进行PCR扩增 ,扩增产